钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用。该钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明专利技术首次从钝鳞紫背苔克隆得到1个可以高效催化黄酮六位羟基甲基化的氧甲基转移酶，体外酶活功能鉴定证明PaF6OMT最适底物是黄芩素和野黄芩素。反应时间和蛋白量对底物转化率的影响的实验证明在合适的蛋白量和一定的反应时间内，可完全催化黄芩素和野黄芩素分别生成千层纸素A和高车前素。

Six - bit hydroxyoxymethyltransferase and its encoding gene and its application in blunt scale

The invention discloses a blunt scale purple - back moss flavone six - bit hydroxy methyltransferase, and its encoding gene and application. The blunt dorsal scales moss six flavonoids hydroxyl methyl transferase, its amino acid sequence is one of the following: (1) the amino acid sequence of SEQ ID No.1 shown; or (2) the amino acid sequence of SEQ ID No.1 shown by one or several amino acid residues and / or replace missing and / or added and the same protein function. The invention is the first to clone 1 methoxyltransferases of six hydroxymethylated flavones from the blunt scale purple moss. In vitro, enzyme activity assay shows that PaF6OMT is the most suitable substrate for baicalein and scutellarin. The effect of reaction time and protein content on substrate conversion rate showed that baicalein and scutellarin could produce thousands of layer A and high Plantin respectively.

【技术实现步骤摘要】
钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用。
技术介绍
千层纸素A和高车前素是黄芩素和野黄芩素的6-OH甲基化的产物，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗真菌、抗炎、抗肿瘤等。有文献报道千层纸素A是目前临床上使用的抗分娩药物安宫宁中的主要有效活性成分。高车前素是传统药物灯盏花乙素在体内的活性代谢产物，但其具有更强的生物活性，口服易于吸收，生物利用度较灯盏花乙素提高了3倍多，具有更强的抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化、抗老年痴呆、治疗缺血性脑血管病等作用。千层纸素A和高车前素有望成为新药的先导化合物，其合成也受到越来越广泛的关注。但是，千层纸素A和高车前素在植物中含量不高，从植物中提取工艺流程复杂，分离纯化困难。有研究通过黄芩素和野黄芩素化学合成千层纸素A和高车前素，合成过程中为保护苯环上其余羟基不被甲基化，合成步骤复杂，合成时间长且需要多种辅助化合物的参与。钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)，是一种苔类植物，结构简单，没有茎叶分化，只有扁平的叶状体，没有真正的根和维管束。目前，对于钝鳞紫背苔的研究相对较少，从钝鳞紫背苔中分离鉴定出能够特异性催化黄酮六位羟基甲基化的氧甲基转移酶还未见报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶及其编码基因与应用。该氧甲基转移酶来自于苔类植物钝鳞紫背苔，属于Ⅰ类氧甲基转移酶(O-methyltransferases,OMTs)，具有镁离子依赖性，是第一个能够高效催化黄酮六位羟基甲基化的氧甲基转移酶，可用于酶法合成千层纸素A和高车前素，其酶活反应条件简单温和，时间短，产物单一，转化率高。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术提供的一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶(PaF6OMT)，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。上述钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶的编码基因也属于本专利技术的保护范围。上述编码基因(PaF6OMT)中，其核苷酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(2)与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。进一步的，本专利技术还提供了含有上述编码基因的表达载体。上述表达载体为重组原核表达载体。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述重组原核表达载体为：在表达载体pET32a中插入上述编码基因。本专利技术还提供了含有上述表达载体的重组细胞、转化体。优选的，所述重组细胞为含有上述表达载体的细胞BL21(DE3)。本专利技术还提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。上述钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶在合成千层纸素A和/或高车前素中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶在催化黄芩素合成千层纸素A中的应用也属于本专利技术的保护范围。上述钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶在催化野黄芩素合成高车前素中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术的有益效果：本专利技术首次从钝鳞紫背苔转录组数据库中筛选出一个氧甲基转移酶，利用PCR成功扩增出其全长序列。通过构建pET32a蛋白表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)得到目的蛋白。体外酶活功能鉴定证明PaF6OMT最适底物是黄芩素和野黄芩素。反应时间和蛋白量对底物转化率的影响的实验证明在合适的蛋白量和一定的反应时间内，蛋白可完全催化黄芩素和野黄芩素分别生成千层纸素A和高车前素。蛋白PaF6OMT可应用于酶法合成千层纸素A和高车前素，具有较高的应用价值和广阔的应用前景。附图说明图1：PaF6OMT基因全长cDNA扩增产物的电泳图。图2：PaF6OMT蛋白SDS-PAGE电泳图；其中：M:蛋白分子质量标准泳道1：空载体pET32a蛋白上清；泳道2：空载体pET32a蛋白纯化；泳道3：PaF6OMT蛋白上清；泳道4：PaF6OMT蛋白纯化.图3：HPLC对反应产物的鉴定，反应底物为黄芩素和野黄芩素；其中：A、D为空载体对照；B、E为PaF6OMT蛋白酶活反应结果；C、F为产物标准品。图4：温度对酶活反应速率的影响。图5A：蛋白量对底物转化率的影响；图5B：反应时间对底物转化率的影响。图6：PaF6OMT的亚细胞定位图；其中：A：激发光下绿色荧光信号；B：激发光下叶绿体的荧光信号C：自然光下烟草表皮细胞；D：A、B、C图的叠加。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1.表达基因PaF6OMT的克隆1.1CTAB-PVP法提取钝鳞紫背苔总RNA(1)取新鲜的钝鳞紫背苔植物材料，清洗干净，用滤纸吸干多余水分，置于研钵中加液氮研磨至材料成粉末状。(2)取适量粉末至提前预冷的离心管中，加800μl65℃预热的CTAB-PVP提取液，上下颠倒混匀。上述CTAB-PVP提取缓冲液配制方法如下：100mMTris·HCl(pH8.0)，2％CTAB(w/v)，2％PVP(w/v)，25mMEDTA，2MNaCl，高压蒸汽灭菌之后巯基乙醇加至0.2％；溶液配置用DEPC处理过的ddH2O，高压灭菌后备用。(3)65℃温浴30min，期间每隔6-10min颠倒混匀一次。(4)冷却后加入600μl氯仿，混匀；4℃13,000rpm离心10min。(5)取上清转至新离心管，加入600μl氯仿，振荡混合均匀后4℃13,000rpm离心10min。(6)重复上步(即用氯仿抽提三次)。(7)小心吸取上清转至新的1.5ml离心管中，加入1/3体积的8MLiCl，-20℃静置3h以上(或4℃静置过夜)。(8)4℃13,000rpm离心10min，弃上清。(9)加入800μl75％乙醇洗涤沉淀2-3次。离心弃上清后挥干剩余乙醇。(10)加入40μlProteinaseK处理后的灭菌水溶解RNA，制得总RNA。使用BioPhotometerplus核酸蛋白测定仪测定提取的RNA浓度及质量。1.2PaF6OMT基因全长扩增1.2.1引物设计利用软件Bioxm2.0的sequenceanalysis程序找出PaF6OMT的开放阅读框(Openreadingframe)。在ORF两侧的非编码区(UntranslatedRegion,UTR)用软件primerpremier5.0设计全长引物PaF6OMT-F/R，对基因进行扩增；全长引物：PaF6OMT-F:GCATTGGAAGGATTGTTTGG；(SEQIDNo.3)PaF6OMT-R:AATTCGCTTGGCATCG；(SEQIDNo.4)1.2.2cDNA合成以提取的钝鳞紫背苔的总RNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶，其氨基酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或(2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。2.权利要求1所述钝鳞紫背苔黄酮六位羟基氧甲基转移酶的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为以下之一：(1)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或(2)与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：程爱霞，张玉莹，许瑞雪，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37