一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法技术

本发明专利技术涉及一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C‑端富集方法，包括：封闭蛋白质自由羧基、蛋白质碱性位点酶切、离子交换色谱分离、肽段羧基端碱性氨基酸剪切。蛋白质样品首先在蛋白质水平上封闭C末端及侧链的自由羧基，然后对蛋白的碱性位点进行酶切以产生羧基端为碱性氨基酸的中间肽段，并采用离子交换色谱对酶切产物进行分级得到多个级分，最后对中间肽段羧基端的碱性氨基酸进行剪切，并将每个级分进行二次离子交换色谱分离以排除保留时间发生偏移的中间肽段，获得蛋白质的C端肽段。本发明专利技术的优点是酶切效率高、去除效率高、富集效率高、可采用多种酶酶切、提高了C端鉴定的覆盖度。

A C- enrichment method for proteins based on carboxypeptidase and strong cation exchange chromatography

The invention relates to a carboxypeptidase exchange chromatography and strong cation based on protein C end enrichment method, including: protein, protein free carboxyl closed site alkaline digestion and ion exchange chromatography, peptide C-terminal basic amino acid shear. Protein samples closed first C end and side chain free carboxyl groups in the protein level, then the basic sites on protein digestion to produce carboxyl terminal peptide as intermediate basic amino acids by ion exchange chromatography, and the digested products were classified by multiple points, finally cut basic amino acid on intermediate peptides the carboxyl terminus, and each fraction was two ion exchange chromatography to eliminate intermediate peptide retention time shift, protein C terminal peptide. The invention has the advantages of high digestion efficiency, high removal efficiency, high enrichment efficiency, multiple enzyme digestion, and improved coverage of C end identification.

【技术实现步骤摘要】
一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法
本专利技术涉及蛋白质C-端富集方法，即一种羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C-端富集方法，以实现蛋白C-端的高效高选择性富集。
技术介绍
蛋白质C末端的修饰与剪切是生物体内常见的翻译后修饰之一，与蛋白质的活性、定位及复合物形成等过程相关。此外，生物体内蛋白的降解促使蛋白产生新的C末端，此类过程与细胞凋亡、趋化因子加工等众多生物学过程及生理机能密切相关。但是，生物样品中蛋白组分复杂，并且含量的动态分布范围宽，而Bottom-up策略使样品的复杂性进一步增加。因此，发展蛋白质C末端肽段的富集方法以提高C末端肽段鉴定的覆盖度，对于了解生物过程及寻找疾病的生物标志物都起到重要作用。蛋白质末端的富集分为正向富集与反向富集。GuoqiangXu等(ACSChemicalBiology2011,6,1015–1020)报道了一种对C-末端肽进行正向富集的方法。利用羧肽酶Y在pH11.6时转肽酶的活性，在蛋白质C-末端特异性的标记上一个带有生物素的氨基化合物，经酶切后，采用生物素-抗生素亲和作用对C-末端肽进行亲和富集。OliverSchill本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C端富集方法，包括：1)封闭蛋白质上的自由羧基：采用羧基活性试剂封闭蛋白质上C端以及侧链的自由羧基；2)蛋白质碱性位点酶切：采用酶切位点为精氨酸或赖氨酸羧基端的蛋白水解酶酶解蛋白质；3)强阳离子交换色谱分离：采用强阳离子交换色谱分离肽段；4)羧肽酶剪切肽段羧基端碱性氨基酸后二次强阳离子交换色谱分离：采用羧肽酶B特异性剪切肽段羧基端精氨酸和赖氨酸后二次强阳离子交换色谱分离。

【技术特征摘要】
1.一种基于羧肽酶和强阳离子交换色谱的蛋白质C端富集方法，包括：1)封闭蛋白质上的自由羧基：采用羧基活性试剂封闭蛋白质上C端以及侧链的自由羧基；2)蛋白质碱性位点酶切：采用酶切位点为精氨酸或赖氨酸羧基端的蛋白水解酶酶解蛋白质；3)强阳离子交换色谱分离：采用强阳离子交换色谱分离肽段；4)羧肽酶剪切肽段羧基端碱性氨基酸后二次强阳离子交换色谱分离：采用羧肽酶B特异性剪切肽段羧基端精氨酸和赖氨酸后二次强阳离子交换色谱分离。2.按照权利要求1所述富集方法，其特征在于：1)所述的羧基活性试剂封闭蛋白质自由羧基，具体步骤如下：将蛋白质进行变性、还原、烷基化后，将溶液转移至3000-10000Da的超滤膜上，离心去除溶剂并采用pH为3-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为3-10的缓冲液中，加入终浓度10-500mM的羧基活化试剂，以及终浓度10-4000mM的羧基活性试剂，反应1-48h后，离心去除溶剂并采用pH为6-10的缓冲液清洗残余试剂后，将蛋白质溶于pH为6-10的缓冲液中，得到溶液A；2)所述的蛋白质碱性位点酶切，具体步骤如下：于所述的溶液A中加入蛋白水解酶进行酶解，蛋白水解酶用量为蛋白质质量的1/5-1/100，酶解时间为2-48h，酶解温度25-45℃，酶解完成后将超滤膜进行离心，离心液为溶液B；3)所述的阳离子交换色谱分离肽段，具体步骤如下：将溶液B除盐，冻干后，采用A相溶解并上样到强阳离子交换柱上进行分离，分离梯度为：0％A相-100％B相线性分离40-100min，流速为0.1-3mL/min，按照2-10min的时间窗口收集4-50个级分，分别冻干，除盐，重溶于10-100mM碳酸氢铵溶液，得到溶液C；按体积百分浓度计，A相：5-30％乙腈+5-10mMpH2-4磷酸二氢纳缓冲液；B相：5％-30％乙腈+200-1000mMpH2-4磷酸二氢纳缓冲液；4)所述的肽段羧基端碱性氨基酸剪切后二次强阳离子交换色谱分离，具体步骤如下：往溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，陈玲凡，单亦初，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21