一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒、制备方法及应用技术

本发明专利技术为一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒、制备方法及应用，属于环境监测领域。试剂盒中包括1块空白96孔酶标板、1支海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品、1支兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体、1支辣根过氧化物酶标记的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液各1支。通过“凝胶过滤层析+离子交换层析”两步法分离纯化了海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白，获得的卵黄脂磷蛋白与卵黄原蛋白具有相同的免疫原性，作为检测卵黄原蛋白的标准品，且热稳定性更佳。本试剂盒可以快速、灵敏的定量检测海水青鳉鱼样本中的卵黄原蛋白，能够为海洋环境雌激素污染的生物监测提供技术手段。

Kit, preparation method and application of a modified quantitative detection of marine medaka egg yolk protein.

Kit, preparation method and the application of the invention is an improved quantitative detection of marine medaka egg yolk protein, which belongs to the field of environmental monitoring. 1 blank 96 microtitor plate, 1 marine medaka eggs yellow lipovitellin standard, 1 Rabbit anti marine medaka eggs yolk protein 1 antibody and horseradish peroxidase conjugated Rabbit anti marine medaka eggs yolk protein antibody, coating liquid, sealing liquid, sample diluent, washing liquid, color liquid and liquid 1 including termination kit. Through the gel filtration chromatography + ion exchange chromatography \two step purification of marine medaka eggs yellow lipophosphoprotein, get the lipovitellin and yolk protein has the same immunogenicity, as the detection standard of vitellogenin, and thermal stability. The kit can be rapid and sensitive quantitative detection of seawater samples in medaka vitellogenin, biological monitoring for the pollution of the marine environment can provide technical means of estrogen.

【技术实现步骤摘要】
一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒、制备方法及应用
本专利技术属于环境监测领域，涉及一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒，具有更佳的检测重复性和精确度，适于海洋环境雌激素污染的生物监测。
技术介绍
环境雌激素是一类种类多样的外源化合物，能够扰乱生物体正常的激素水平，损害内分泌系统功能，并进一步影响野生动物的繁殖过程、种群性别比例及规模。近年来，海洋环境雌激素污染问题引起了越来越多的关注。卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vtg)是卵生动物卵黄蛋白的前体，在17β-雌二醇的刺激下，由肝脏合成与分泌，通过血液循环转运至卵巢，作为胚胎发育的营养源。通常情况下，Vtg由卵黄生成期的雌鱼大量合成，而雄鱼与幼鱼因内源雌激素水平较低而不能合成或合成量很低。但雄鱼与幼鱼同样具有Vtg基因，在外源雌激素的作用下，也可被诱导合成Vtg。因此，雄鱼或幼鱼的Vtg水平是指示环境雌激素污染的理想指标。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)因具有检测灵敏度高、操作简便、快速的优点，已被广泛用于Vtg的检测。目前，已建立VtgELI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括1个盒体，盒体内装有1块空白96孔酶标板；1支海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品，使用前用样品稀释液稀释至所需浓度；1支兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体，使用前用包被液稀释至5μg/mL；1支辣根过氧化物酶标记的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体，使用前用样品稀释液按1：2500的比例稀释；包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液各1支；所述的包被液为碳酸盐缓冲液；封闭液、样品稀释液、洗涤液为磷酸盐缓冲液；显色液为单组分显色液；终止液为H2SO4水溶液。

【技术特征摘要】
1.一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括1个盒体，盒体内装有1块空白96孔酶标板；1支海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品，使用前用样品稀释液稀释至所需浓度；1支兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体，使用前用包被液稀释至5μg/mL；1支辣根过氧化物酶标记的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体，使用前用样品稀释液按1：2500的比例稀释；包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液及终止液各1支；所述的包被液为碳酸盐缓冲液；封闭液、样品稀释液、洗涤液为磷酸盐缓冲液；显色液为单组分显色液；终止液为H2SO4水溶液。2.根据权利要求1所述的一种改良的定量检测海水青鳉鱼卵黄原蛋白的试剂盒，其特征在于，所述的包被液为50mM的碳酸盐缓冲液，pH9.6；所述的封闭液为含2％BSA的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述的样品稀释液为含0.05％Tween-20及1％BSA的磷酸盐缓冲液；所述的洗涤液为含0.05％Tween-20的150mM的磷酸盐缓冲液，pH7.4；所述的显色液为TMB单组分显色液；所述的终止液为2M的H2SO4水溶液。3.权利要求1或2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于制备盒体内的海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品、兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体，包括以下步骤：所述的海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：1)取卵黄形成后期的雌性海水青鳉鱼卵巢组织，去除结缔组织，收集鱼卵；加入鱼卵3～4倍体积、4℃预冷的匀浆缓冲液，4℃机器匀浆后，10000rpm/min离心20分钟，收集上清液；所述的匀浆缓冲液为25mM氨基丁三醇Tris，内含0.07MNaCl和0.5TIU/mL抑肽酶，并用HCl或NaOH调整pH值为7.6；2)向上清液中缓缓加入(NH4)2SO4粉末至70％的饱和度，盐析过液；10小时后，在4℃下，以8000rpm/min离心10分钟，弃去上清液，将沉淀重新溶解于25mMTris-HC缓冲液中，获得卵匀浆提取液；3)取1mL卵匀浆提取液加入至层析柱，用含0.07MNaCl的25mMTris-HCl缓冲液洗脱；收集含有海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白的洗脱峰进行离子交换层析，分别用含0.07M、0.1M、0.2M、0.3M和1.0MNaCl的25mMTris-HCl缓冲液进行不连续洗脱，收集0.2M洗脱组分，即为海水青鳉鱼卵黄脂磷蛋白标准品；所述的兔抗海水青鳉鱼卵黄原蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤：1)采用水体暴露17β-雌二醇的方法诱导海水青鳉鱼合成卵黄原蛋白，其中，17β-雌二醇的暴露浓度为50～200μg/L；2)取暴露后的海水青鳉鱼，称重，并加入海水青鳉鱼3倍质量的匀浆缓冲液，冰浴匀浆，匀浆液低温离心后收集上清液；3)将收集到的上清液用凝胶过滤层析，用25mMTri-HCl匀浆缓冲液冲流洗脱层析柱，收集主洗脱峰得到洗脱液，其中，25mMTri-HCl匀浆缓冲液内含0.07MNaCl和0.5TIU/mL抑肽酶，pH7.6；再将洗脱液加入阴离子交换层析柱，分别用含有0.07、0.1、0.2和1MNaCl的25mMTris-HCl匀浆缓冲液继续冲流洗脱层析柱，每个梯度冲洗60min，收集0.2M洗脱峰，获得海水青鳉鱼卵黄原蛋白，其中，25mMTris-HCl匀浆缓冲液内含0.5TIU/mL抑肽酶，pH7.5；4)取海水青鳉鱼卵黄原蛋白，加入等体积的弗氏完全佐剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫玉峰，易先亮，钟熙，张绍帅，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21