一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种青霉素高产菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供上述菌株在青霉素生产中的应用，属于抗生素生产及其应用的技术领域。本发明专利技术的菌株将青霉素发酵单位提高了13.2％，有效地提高了青霉素的产量、降低了生产成本，其筛选方法包括以下步骤：(A)原生质体制备；(B)高能电子诱变；(C)理性化筛选；(D)摇瓶筛选。本发明专利技术提供了一种筛选方法目的性强、突变株几率高的青霉素筛选方法及其应用。

【技术实现步骤摘要】
一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用
本专利技术涉及一种用于抗生素生产的工业菌株及其筛选方法和在发酵领域中的应用，具体涉及一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用。
技术介绍
青霉素(Penicillin)属于β-内酰胺类抗生素，是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素；青霉素还可以作为原料，合成一系列的半合成青霉素类和半合成头孢菌素类抗生素。青霉素是由产黄青霉菌(PenicilliumChrysogenum)在发酵过程中通过次级代谢而合成的。目前，产黄青霉菌优良菌种的选育方法通常采用杂交育种、化学诱变剂诱变育种、物理诱变剂诱变育种和基因工程育种等，但筛选出来用于青霉素发酵的产黄青霉菌菌种，其生产能力较低。王成等公开了一种利用高能电子照射青霉素孢子的诱变方法(王成，张军剪，尹贵超.产黄青霉菌高能电子诱变选育.煤炭与化工2014，37(2)：68-69.)，该方法利用高能电子直接诱变青霉素孢子，由于真菌孢子壁厚，具有照射剂量大，致死率高，突变率低等缺点；利用高浓度苯乙酸平板筛选耐受高浓度苯乙酸的突变株，筛选得到的突变株13-6-55号发酵单位比对照提高3.6％，其提高幅度较低，而且苯乙酸加入量增多。在青霉素发酵领域，如何提高青霉素菌种的发酵能力，进而提高青霉素产量，降低生产成本，一直是本领域生产企业及科研人员的重点研究课题和努力的方向。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是如何提供一种青霉素高产突变株几率高的青霉素及其筛选方法和应用。为实现本专利技术的目的，本专利技术提供了一种青霉素高产菌株，该菌株的名称为产黄青霉(PenicilliumChrysogenum)B131536，保藏编号为CGMCCNo.13576，保藏日期为2017年1月9日，保藏单位为CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术所提供的B131536菌株其微生物学特征如下：单菌落的形态为：菌落呈白色、圆形、中间凸起、菌落布满规则褶皱；孢子呈白色或灰白色，显微镜下孢子呈圆形。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种青霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：(A)原生质体制备：A-1)将出发菌株接种到菌丝培养基摇瓶中培养，得到菌丝培养液；A-2)将菌丝培养液进行离心处理，弃上清液，向下层沉淀中加入等体积的无菌水，振荡后再离心处理；弃上层清液后加入缓冲液，搅拌后离心，弃去上清后在下层沉淀中加入LyzingenzymesL-1412混合酶，水浴中振荡进行酶解，得到酶解液；A-3)将酶解液过滤除去残余未酶解的菌丝，离心收集，得到原生质体，用缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度达到107/mL时，停止酶解，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；(B)高能电子诱变：利用电子直线加速器照射的一组西林瓶中的原生质体悬液；(C)理性化筛选：将照射组的原生质体悬液和未经照射组的原生质体悬液分别稀释后，涂布在含有等渗分离培养基皿中进行培养，并从照射组中挑选目标菌落；(D)摇瓶筛选：D-1)将目标菌落接种到斜面培养基上培养，斜面上菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到种子培养基摇瓶中培养，菌种成熟后将其接种到30～40mL发酵培养基摇瓶中培养，得到发酵液；D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价，效价高于未经照射组15％的发酵液所对应的菌株再次进行摇瓶筛选确认，摇瓶复筛与步骤(D-1)相同，摇瓶筛选发酵液中青霉素效价最高的发酵液对应的菌株即为高产的产黄青霉菌。本专利技术技术方案的进一步改进在于：步骤A-1)所用的菌丝培养基按质量体积比加入，其成分组成为：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，酵母粉1.5～3.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.6％，其余为蒸馏水，将菌丝培养基的pH调节至6.0±0.2，菌丝培养的温度为25±0.5℃，相对湿度为40％～60％，培养2～3天，离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～15min。本专利技术技术方案的进一步改进在于：步骤A-2)的缓冲液为0.7mol/L氯化钾溶液与0.01mol/L磷酸溶液的混合液，缓冲液的pH为6.5，LyzingenzymesL-1412混合酶的重量百分数为0.4％～0.5％，加入量为30～40mL，步骤A-3)中的温度为30±0.5℃，水浴振荡酶解的转速为100～200r/min，时间为3～5小时。本专利技术技术方案的进一步改进在于：步骤(B)中采用的是BF-5型电子直线加速器，距离为20～30cm，辐射剂量为30～90Gy/s，照射时间为10～90秒。本专利技术技术方案的进一步改进在于：步骤(C)中原生质体悬液稀释10-3～10-5倍，筛选的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养12～15天，挑选的目标菌落为诱变后菌落直径大于未经照射组的菌落直径10％以上的菌落，所用等渗分离培养基按质量体积比加入，其成分组成为：红糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化钠0.5～2.0％，硫酸钙0.01～0.08％，磷酸二氢钾0.0005～0.002％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸铜0.0001～0.001％，硫酸亚铁0.0001～0.001％，琼脂1.5～2.0％，用0.7mol/L氯化钾溶液配制，加入苯乙酸至0.4～0.6mg/mL，将菌丝培养基的pH调节至6.8±0.2。本专利技术技术方案的进一步改进在于：步骤(D)斜面培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养5～8天，摇瓶中培养的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％，摇瓶培养的转速为220～250rpm，培养时间为38～170小时。一种利用青霉素高产菌株在青霉素发酵生产中的应用，将该高产菌株菌液接种到小米孢子培养基中，小米孢子成熟后接种到种子罐培养基中，菌种成熟后将其接种到发酵罐培养基中，培养后制得青霉素发酵液。本专利技术技术方案的进一步改进在于：小米孢子培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40～60％条件下避光培养6～8天，种子罐培养基在25±0.5℃，120～150rpm，通气比1:0.8～1:1.2的条件下培养60～70小时，发酵罐培养基的培养温度为25±0.5℃，100～130rpm，通气比1:1～1:1.5，残糖含量0.01～0.03mg/mL，氨氮含量0.1～0.3mg/mL，苯乙酸含量0.2～0.3mg/mL，pH值6.2～6.6的条件下培养6～8天。本专利技术技术方案的进一步改进在于：所用小米孢子培养基，按质量体积比计算，其成分组成为：蔗糖0.2～0.8％，玉米浆1.0～1.5％，氯化钠0.1～0.3％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸亚铁0.0001～0.001％。由于采用了上述技术方案，本专利技术取得的技术进步是：本专利技术采用高能电子照射产黄青霉菌原生质体的诱变方法，由于原生质体去除了真菌表面较厚的细胞壁层，对物理诱变剂更加敏感，具有照射剂量小，致死率低，突变率高等的优点。苯乙酸作为前体对青霉素合成是必需的，但其对青霉素菌丝具有毒性，抑制青霉素菌丝的生长，苯乙酸浓度越高对青霉素菌丝生长抑制越强。本专利技术利用高能电子主动诱变产黄青霉菌，使产黄青霉菌的基因组发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青霉素高产菌株，其特征在于：该菌株的名称为产黄青霉菌(Penicillium Chrysogenum)B131536，保藏编号为CGMCC No.13576，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2017年1月9日。

【技术特征摘要】
1.一种青霉素高产菌株，其特征在于：该菌株的名称为产黄青霉菌(PenicilliumChrysogenum)B131536，保藏编号为CGMCCNo.13576，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2017年1月9日。2.一种权利要求1的青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤，(A)原生质体制备：A-1)将出发菌株接种到菌丝培养基摇瓶中培养，得到菌丝培养液；A-2)将菌丝培养液进行离心处理，弃上清液，向下层沉淀中加入等体积的无菌水，振荡后再离心处理；弃上层清液后加入缓冲液，搅拌后离心，弃去上清后在下层沉淀中加入LyzingenzymesL-1412混合酶，水浴中振荡进行酶解，得到酶解液；A-3)将酶解液过滤除去残余未酶解的菌丝，离心收集，得到原生质体，用缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度达到107/mL时，停止酶解，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；(B)高能电子诱变：利用电子直线加速器照射的一组西林瓶中的原生质体悬液；(C)理性化筛选：将照射组的原生质体悬液和未经照射组的原生质体悬液分别稀释后，涂布在含有等渗分离培养基皿中进行培养，并从照射组中挑选目标菌落；(D)摇瓶筛选：D-1)将目标菌落接种到斜面培养基上培养，斜面上菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到种子培养基摇瓶中培养，菌种成熟后将其接种到30～40mL发酵培养基摇瓶中培养，得到发酵液；D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价，效价高于未经照射组15％的发酵液所对应的菌株再次进行摇瓶筛选确认，摇瓶复筛与步骤(D-1)相同，摇瓶筛选发酵液中青霉素效价最高的发酵液对应的菌株即为高产的产黄青霉菌。3.根据权利要求1所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤A-1)所用的菌丝培养基按质量体积比加入，其成分组成为：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，酵母粉1.5～3.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.6％，其余为蒸馏水，将菌丝培养基的pH调节至6.0±0.2，菌丝培养的温度为25±0.5℃，相对湿度为40％～60％，培养2～3天，离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～15min。4.根据权利要求3所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤A-2)的缓冲液为0.7mol/L氯化钾溶液与0.01mol/L磷酸溶液的混合液，缓冲液的pH为6.5，LyzingenzymesL-1412混合酶的重量百分数为0.4％～0.5％，加入量为30～40mL，步骤A-3)中的温度为30±0.5℃，水浴振荡酶解的转速为10...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志钢，王平，尹贵超，王成，张军剪，王淑琳，王云，
申请(专利权)人：华北制药河北华民药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河北,13