一种用于评价细胞损伤的方法技术

本发明专利技术涉及用多种聚合物材料或者组合制备的微流控芯片，实现对丙二醛的微量生物化学反应，产生的终产物固定到载体上并装载于微芯片中，通过光化学原理测定其靶分子的浓度。这些方法以及多种组合的方法及其制成品所属的系统可以用于评估2型糖尿病并发症等引起的细胞损伤程度的评估。

A method for evaluating cell damage

The invention relates to the use of various polymer materials or a combination of the preparation of microfluidic chip, micro biological and chemical reaction of MDA, the final product produced by fixed to the carrier and loaded into the micro chip, determination of its target molecules by photochemical principle. These methods, as well as a combination of methods and their manufactured systems, can be used to assess the extent of cell damage caused by complications such as type 2 diabetes mellitus.

【技术实现步骤摘要】
一种用于评价细胞损伤的方法
：本专利技术属于生物医药
，涉及一种利用微流芯片方式测定糖尿病并发症相关的标志分子的含量的方法描述以及相应的装置的制备工艺等。
技术介绍
：机体老化过程在生物学认为是属于正常的生物学程序设定的进程，但是自从开创了自由基的研究领域之后，逐步认识到在所谓的“老化”进程与许多的“疾病”之间存在在于各个层面的化学的共通的联系。这些方面的进展与积累的知识，提高了对人类衰老流程的理解。在理解本专利技术的工作之前有必要说明的是，利用遗传学，生物学方法进行个体的“老化”的判定与本专利技术所涉及的“老化相关的疾病”(age-associateddiseases)不在同一个范畴。需要指出的是，我们所关注的老化以及老化性性疾病，举例如，老年心血管病，中风，癌症，器官功能衰退，骨关节、肌肉劳损，糖尿病并发症等，估计这个名单还会继续扩大，这一类别的“老化”是我们关注的范畴。具体的是，我们在这个申请例子中只集中在糖尿病有关的老化的应用与说明，而更具体的在于，在本工作与知识产权有关的说明中，本申请披露与糖尿病性质的老化进程相关的老化的指标的微流控芯片检测的技术细节。近年的一种理论认为，慢性病相关的老化是由许许多多的意外的，随机的，无可避免的“错误”所产生，这方面的数学模型都试图定量地说明老化的这个原理，医学实验工作的贡献在于对于这个产生“错误”的原因和发生源提供了生物医学方面的知识积累，帮助人们理解如何设计出来控制、干预老化的进程。1956年至今，哈曼(Harman，1956，2006)的研究发现，“老化”其实是一种自由基介导的慢性损害，可以列入疾病的范畴，这种疾病有多个病因包括由活性氧(ROS)以及一系列ROS参与的的继发的损害所造成。例如，其中之一，线粒体DNA(mtDNA的)是一个多拷贝染色体外遗传组件，暴露于高稳态水平ROS和由呼吸链产生的线粒体自由基，它很容易被氧化损伤并造成基因的突变，超过20％报道的在人类线粒体DNA上的突变已经确认是老年性损伤相关联的。在上述的过程发生之中，需要密切关注的应该是不饱和脂肪酸的作用。不饱和脂肪酸是细胞、组织等生物单位膜的基本组分，含量在不同的组织里面都具有比较大的差异，它与ROS和由呼吸链中产生的自由基接触后随即会产生链的断裂，氧化，释放丙二醛(Malonicdialdehydealchol，MDA)，作为一种活性的中间物，该醛是一种剧毒分子，MDA通过对细胞内的功能蛋白质，酶，因子，DNA等进行修饰，形成加合物。这类物质可以在各种体液里面出现，例如，当组织出现微小的病变后，组织的MDA的水平增加，随即在尿液中MDA也会出现增加，同时增加的还有几个MDA的衍生物从尿液排泄，表现为尿中的该类物质水平增加。有MDA的主要尿代谢物已被确定为N-ε-(2-丙烯醛)赖氨酸，以及其N-α乙酰酯。Rio(2005)的研究工作说明，上述的氧化应激是多种慢性疾病和衰老过程中一个极其重要的底层的过程。脂类尤其是多不饱和脂肪酸，是这类氧化应激的主要的攻击靶标，并产生复杂的生物化学反应以及脂质氧化引起的一些次级产品。这些产品主要是醛，与加剧氧化损伤的能力，它们存在于整个机体组织，与生物大分子如核酸、蛋白质等相互作用，不可逆的损坏细胞以及细胞器的生理功能。值得注意的是，多不饱和脂肪酸作为氧化应激的攻击靶标，具有重大的意义，因为多不饱和脂肪酸存在于机体组织，细胞，细胞器，单位膜上面，分布非常广泛，含量与分布的范围很大；尤其是在检测方面的意义在于，不同的组织，细胞种类，不同的部位，其多不饱和脂肪酸的含量，分布都具有各自的特点，在受到氧化损坏释放的时候，会出现与组织、细胞种类、器官部位关联的特殊的释放的时间、量的模式，可以解释为，这种时候检测到的信号是具有时间与空间编码意义的特异信号。自20世纪60年代以来，在量化评估氧化应激的水平的体内和体外研究方面，丙二醛(MDA)是主要的和研究最多的的多不饱和脂肪酸过氧化产物分子。因为认识MDA的意义不仅仅在于它是一个表征氧化应激程度的公认的分子标记物，它与DNA和蛋白质的相互作用造成的致突变、损伤在多种慢性病损研究的毒理作用方面也是具有重要的意义。PUFA脂质氧化的体内过程简单描述是这样的：多不饱和脂肪酸遇到自由基之后，主要通过多级自由基反应先期形成前列腺素样或者甲基亚油酸的前体物质，这些前体物质进一步通过β剪切过程作为前一级物质继而转变为毒性分子MDA。生物样品中的丙二醛的主要来源是多不饱和脂肪酸参与的过氧化过程，参与的结构有两个或更多的亚甲基间隔的双键。MDA前体属于一类非挥发性的性质，前体的结构类似于一类二环内过氧化物，类似前列腺素样的物质，以及亚油酸甲酯样的结构等，接着转化为MDA，体内外的过程是类似的.。丙二醛也可在体内通过酶促生成。各种前列腺素合成过程的知识表明，血栓素A2(TXA2)的合成导致丙二醛和12(S)-羟基8，10(E，E)-heptadecadienoic酸(HHT)以高收率产生所述的中间体分子以及MDA。生理状态的中性pH下，MDA是一种烯醇阴离子，具有相对低的化学反应性能，然而，这种分子能够与核酸碱基相互作用，以形成几种不同结构的加合物，已知的嘧啶，嘌呤，2-脱氧核糖等，其中比较重要的有M1G，在细菌和哺乳动物体内的细胞里发现了M1G能够诱导序列依赖性移码突变和碱基对取代。另一方面，丙二醛可以造成NDA链间交联并产生突变，同时也发现，DNA和组蛋白之间存在MDA引发的交联，这些都是造成肿瘤发生的原因。丙二醛与伯胺反应形成Nε-(2-丙烯醛)赖氨酸以及赖氨酸-赖氨酸交联体。这些反应产物被检测在氧化的脂蛋白(LDL)和载脂蛋白B被认为是参与受损相互作用的变性脂蛋白，这种化学反应是器官血管内壁或者组织微循环损坏的基础，在糖尿病很早期的发展过程中就会出现。对于胶原蛋白的情形比较特殊，胶原蛋白作为血管内壁以及细胞间组织的基本结构性物质，生理功能的维持要借助正确的结构。即使在没有发生Nε-(2-丙烯醛)赖氨酸以及赖氨酸-赖氨酸交联体的时候，一样会发生MDA介导的肽链之间的交联，造成分子活性的失能。所以用MDA的产物交联赖氨酸作为标志物来检测，监控毒性发展的时相，相对于监控MDA的水平变化量或者累计量还要晚一些。MDA能够诱导蛋白质交联，MDA的水平升高与阿尔茨海默氏(AD)的关联关系已经逐渐被确认。按照目前的理解，虽然AD有着复杂的营养和遗传危险因素和倾向，早期营养干预现在证明具有非常确定的重要性，通过在膳食补充剂补充含有硫辛酸的混合物，乙酰基-L-肉碱，磷脂酰甘油，十二碳六烯酸，和磷脂酰丝氨酸等自由基消除剂，可以明显地延缓AD的进展与认知能力的下降，但是对于是否目前的自由基清除药物的使用是否正确也出现了一些争议，许多研究者建议通过严密的监控MDA的水平，来指导合理使用自由基清除剂、抗氧化剂是比较完善的方式。发生在核糖体上的蛋白质合成普遍受所有与老化相关的生物学过程的影响。有一个关于该机制没有明确的，但是已经取得共识的发现，即随着老化的发展，机体组织细胞的蛋白质翻译机能出现了相应的下降。延伸步骤是特别是受影响的老化的改变的结果延伸因子-2(eEF-2)中，单体蛋白的那在催化沿着mRNA的核糖体的移动蛋白质的合成。eEF本文档来自技高网...

【技术保护点】
本申请公开了可用于测定液体中丙二醛的方法，包括为此目的制备的PMMA三明治结构，PMMA‑PDMS，PDMS‑玻璃等微流芯片结构；也制备了可与之配套的反应基质、载体微珠，将反应底物固定到检测区的固相表面处理方法；用这样制作的微流芯片用于测定2型糖尿病病人尿样的丙二醛的含量。

【技术特征摘要】
1.本申请公开了可用于测定液体中丙二醛的方法，包括为此目的制备的PMMA三明治结构，PMMA-PDMS，PDMS-玻璃等微流芯片结构；也制备了可与之配套的反应基质、载体微珠，将反应底物固定到检测区的固相表面处理方法；用这样制作的微流芯片用于测定2型糖尿病病人尿样的丙二醛的含量。2.权利要求1所涉及的是一种用于测定2型糖尿病人尿液丙二醛含量的微流芯片技术。3.权利要求1所涉及的样品测试方法涉及到如何使用微流芯片测定尿液样品中丙二醛含量的技术路线。4.根据权利要求1，权利要求2，权利要求3所述的，本申请提出的微流芯片技术路线区别于其它技术的特征在于被应用于2型糖尿病病人的尿液样品的丙二醛含量的检测。5.根据权利要求4所述，微流芯片的材料包括PMMA，PDMS，玻璃，纳米金粒子等。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：马子敏，张肇鲲，
申请(专利权)人：马子敏，
类型：发明
国别省市：北京,11