一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用，属于微生物技术领域。该细菌是发光细菌Fc‑11‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年12月05日，保藏编号为CGMCC No.13424，分类命名为：Vibrio toranzoniae。本发明专利技术还公开了上述发光细菌在百菌清残留检测中的应用。本发明专利技术的发光细菌Fc‑11‑1丰富了发光细菌物种资源,是不同于现有已报道的11种发光细菌的新型发光菌株。本发明专利技术提供了一种发光细菌在百菌清残留检测中的应用，检测方法具有成本低、操作简单、不需要贵重或大型仪器设备等优点。

A luminescent bacterium and its application in detection of chlorothalonil residues

The invention discloses a luminescent bacterium and its application in the detection of chlorothalonil residues, belonging to the field of microbial technology. The bacteria were Fc 11 luminescent bacteria 1, preserved in general microbial center Chinese microbe preservation management committee, the collection date is December 2016 05, the preservation number is CGMCC No.13424 classification, named: Vibrio toranzoniae. The invention also discloses the application of the luminescent bacteria in the detection of chlorothalonil residues. The invention of the luminescent bacteria Fc 11 1 rich luminescent bacteria species resources, is different from the existing reported 11 new luminescent luminescent bacteria strains. The invention provides an application of a luminescent bacteria in the detection of chlorothalonil residues, and the detection method has the advantages of low cost, simple operation, no need of expensive or large instruments and equipment, etc..

【技术实现步骤摘要】
一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用
本专利技术涉及一株发光细菌及其在百菌清残留检测中的应用，属于微生物

技术介绍
百菌清(Chlorothalonil,CHT)，化学名为2,4,5,6-四氯-1,3-二氰基苯，是一种广谱保护性杀菌剂，农业生产中主要用于防治果蔬类真菌病害。由于百菌清对植物体具有良好的黏着性和使用的广泛性,因此百菌清及其代谢产物在果蔬、土壤及水中均有较大的残留。美国国家环境保护总署(U.S.EPA)已将百菌清列为可能使人类致癌的物质之一，其对环境和食品安全具有潜在威胁。百菌清在土壤中经光、微生物或酶等作用后转化为羟基百菌清，其毒性、稳定性增加，并能溶于水，对环境和食品安全造成更为严重的威胁。目前百菌清的检测方法主要有气相色谱法和液相色谱法以及酶联免疫法，但是这些方法在实际应用中存在前处理复杂、仪器试剂昂贵等缺点。发光细菌检测法是用于有害物质检测的生物方法，可通过发光细菌发光强度的变化来测定有害物质的浓度或评价其毒性，该方法具有灵敏、快速、成本低等优点，在食品安全和环境监测等领域应用日益广泛。
技术实现思路
本申请的专利技术人拟于海水环境和海洋生物中分离筛选发光细菌，并初步应用于果蔬污染物百菌清残留的生物检测，以期建立百菌清检测的快速、简便方法。本专利技术的目的之一，是提供一株发光细菌。本专利技术的发光细菌Fc-11-1丰富了发光细菌物种资源,是不同于已报道的11种发光细菌的新型发光菌株。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一株发光细菌Fc-11-1，已于2016年12月05日保藏在位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.13424，分类命名为Vibriotoranzoniae，其具有以下特性：(1)在暗室中发出明亮的蓝绿色可见光，具有发光特性；(2)革兰氏阴性菌；(3)在发光固体培养基上的菌落为圆形类似馒头状，表面光滑湿润，边缘整齐，超过24h后菌落周围呈锯齿状；(4)油镜下观察，呈杆状或弧状；上述发光细菌Fc-11-1的分离方法，包括以下步骤：(1)制备培养基发光细菌固体培养基(分离培养基)：甘油3mL、酵母粉5g、胰蛋白胨5g、碳酸钙1g、琼脂20g、陈海水1000mL，pH值7.8-8.0，121℃灭菌20分钟；发光细菌液体培养基：酵母粉5g、胰蛋白胨5g、氯化钠30g、磷酸氢二钠5g、磷酸二氢钾1g、甘油3mL，pH值7.6，121℃灭菌20分钟；海水2216E琼脂斜面培养基：蛋白胨5g、酵母粉1g、磷酸铁0.01g、琼脂20g、陈海水1000mL，pH值7.6，121℃灭菌20分钟；(2)将新鲜捕获的海鱼，于无菌环境下，用无菌3％NaCl溶液冲洗鱼体表杂物后，分别采集5-6片鱼鳞、鱼鳃、80％鱼肠，然后分别放入含有玻璃珠的45mL无菌3％NaCl溶液，并置于涡旋震荡器上震荡2-3分钟，充分混匀后，置于无菌超净台；(3)分别吸取混匀后的鱼鳞、鱼鳃、鱼肠悬液200μL注入到海水2216E琼脂培养基平板中，再用涂布棒涂布均匀，静置1min，放入25℃培养箱中，倒置培养；(4)用接种针挑取生长的菌落，划线接种于发光细菌固体培养基平板中，放入25℃培养箱中，倒置培养，直到有菌落生成，取出；置于暗室观察，对发出荧光的菌落做好标记，编号；(5)用接种针挑取标记好的发光菌落，进行连续划线接种，直到得到可在暗室发出荧光的纯菌落。上述陈海水，是从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。上述发光细菌Fc-11-1的鉴定方法，包括以下步骤：(1)观察平板菌落的形态大小、通过革兰氏染色观察细胞形态；(2)Biolog鉴定按照Biolog微生物自动鉴定仪提供的操作手册，调整接种菌悬液浊度接种至96孔GN2微孔鉴定板中，于25℃培养至第24小时、48小时、72小时，结合“人工”及“自动”两种读板模式，分别测定3次，得出鉴定结果。(3)PCR模板的制备将过夜培养的发光细菌菌悬液配制成108CFU/mL(OD600＝0.1)，取其中3μL转入装有100μL无菌双蒸水的1.5mL离心管中，在99℃水浴10min，10000g离心10min，冷却后取上清液作为PCR反应模板。可将提取的DNA模板置于-20℃冰箱中保存。(4)16SrDNAPCR扩增发光细菌16SrDNAPCR扩增所用引物为细菌16SrDNA通用引物，上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增的体系(25μL)：GoTaqGreenMasterMix12.5μL，上游引物27F1μL，下游引物1492R1μL，模板DNA2.5μL，ddH2O8μL。PCR扩增的程序为：95℃预变性3min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。(5)16SrDNAPCR产物测序及系统发育树构建16SrDNAPCR产物经纯化后送宝生物工程(大连)有限公司测序。测序所得基因序列提交到NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)进行Blast比对。采用MEGA5.05软件以Neighbor-joining统计方法自展1000次进行系统发育树的构建。本专利技术的目的之二，是提供上述发光细菌在百菌清残留检测中的应用。本专利技术的发光细菌Fc-11-1可用于果蔬中百菌清残留的检测，具有成本低、操作简单、不需要贵重或大型仪器设备等优点。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一株发光细菌在百菌清残留检测中的应用。本专利技术的目的之三，是提供一种百菌清残留检测的方法。本专利技术的检测方法，具有反应灵敏、成本低、操作简单、不需要大型贵重仪器设备等优点。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种百菌清残留检测的方法，包括如下步骤：(1)称取待测果蔬样品200g，匀浆或搅拌粉碎均质，得到待测样品；(2)取步骤(1)得到的待测样品25g置于250mL锥形瓶中，加入60mL丙酮及质量百分比分数为50％的磷酸2mL，振摇2min，过滤，用20mL丙酮洗涤锥形瓶2次，滤液全部移入250mL分液漏斗中，并加入20g/L硫酸钠溶液100mL，摇匀后用60mL环己烷一共提取3次，静置分层后，提取液经无水硫酸钠漏斗干燥，减压浓缩至近干，后用氮气吹干，用25mL无菌双蒸水定容，涡旋混合，将其转移至试管中，得到百菌清提取物；(3)制备浓度为0-100μg/kg的百菌清标准溶液；(4)将分离得到的发光细菌Fc-11-1单菌落接种于10mL发光细菌液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养20h，即为种子液；将种子液1mL接种至150mL液体发光培养基中，25℃、150r/min振荡培养,得到测试用菌液；(5)当步骤(4)得到的测试用菌液的发光强度每秒光子计数为3900000-4200000时,取步骤(2)得到的百菌清提取物与步骤(4)得到的测试用菌液等体积混合均匀,同时分别取步骤(4)得到的测试用菌液与步骤(3)得到的百菌清标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株发光细菌，其特征在于，该细菌是发光细菌Fc‑11‑1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13424，分类命名为：Vibrio toranzoniae。

【技术特征摘要】
1.一株发光细菌，其特征在于，该细菌是发光细菌Fc-11-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13424，分类命名为：Vibriotoranzoniae。2.一种如权利要求1所述的发光细菌在百菌清残留检测中的应用。3.一种百菌清残留检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)称取待测果蔬样品200g，匀浆或搅拌粉碎均质，得到待测样品；(2)取步骤(1)得到的待测样品25g置于250mL锥形瓶中，加入60mL丙酮及质量百分比分数为50％的磷酸2mL，振摇2min，过滤，用20mL丙酮洗涤锥形瓶2次，滤液全部移入250mL分液漏斗中，并加入20g/L硫酸钠溶液100mL，摇匀后用60mL环己烷一共提取3次，静置分层后，提取液经无水硫酸钠漏斗干燥，减压浓缩至近干，后用氮气吹干，用25mL无菌双蒸水定容，涡旋混合，将其转移至试管中，得到百菌清提取物；(3)制备浓度为0-100μg/kg的百菌清标准溶液；(4)将分离得到的发光细菌Fc-11-1单菌落接种于10mL发光细菌液体培养基中，25℃、150r/min振荡培养2...

【专利技术属性】
技术研发人员：段效辉，李金庆，赵钰玲，王海涛，王颖，刘鹏，尚迪，贺丽娜，颜显辉，
申请(专利权)人：烟台出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东,37