一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法技术

本发明专利技术公开一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。将土壤样品预处理得第一悬混液；震荡破碎得破碎后的第一悬混液；超声，离心，收集第一上清液；用冷丙酮沉淀得到蛋白溶液；精密称取含蛋白质的蛋白溶液，加入单一蛋白酶或者蛋白酶组合，孵育过夜得多肽溶液；加入分离剂1涡旋，分离剂2涡旋，离心，静置，将约90％的含肽段的下层相转移到新的离心管中；再加入分离剂3，涡旋混匀后，离心，取下层；合并两次所得肽段溶液进行脱盐处理，收集洗出液；经离心浓缩干燥后，重新溶解肽段样品，直接上机分析。本发明专利技术所述方法操作简单、稳定性强、回收率高、提取全面而且通量高，对大量开展土壤蛋白质组学的相关研究具有重大的意义。

Sample preparation method for soil macro protein proteomics study

The present invention discloses a sample preparation method for soil macro protein proteomics study. The soil sample pretreatment was the first suspension; shock broken broken after the first suspension; ultrasound, centrifugation, collecting the supernatant; obtain a protein solution with cold acetone; protein solution accurately weighed containing protein, protease or join the single protease combination, incubated overnight to the peptide solution; adding separating agent 1 scroll, scroll centrifugal separation agent 2, and static, to approximately 90% of the peptides containing the lower phase shift to the new centrifugal tube; adding separation agent 3, vortexmixing after centrifugation, taking the lower two times; with the peptide solution was desalted by centrifugation, collecting eluate; after drying, the re dissolved peptide samples, direct machine analysis. The method of the invention has the advantages of simple operation, strong stability, high recovery rate, comprehensive extraction and high flux, and is of great significance for carrying out a great deal of research on soil proteomics.

【技术实现步骤摘要】
一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法
本专利技术涉及到以蛋白组学分析为目的的全蛋白提取和处理方法，尤其是一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。
技术介绍
随着土壤宏基因组学的日益成熟和发展，作为后基因组时代重要技术平台的土壤宏蛋白质组学越来越受到关注。土壤蛋白质在碳氮磷的生物地球化学循环以及有机物的积累方面发挥重要作用，与土壤质量与可持续发展息息相关。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等。宏蛋白质组学是研究整个生态系统内所有微生物来源的蛋白质种类和丰度变化的技术手段。在过去的10年中，宏蛋白质组学极大地加深了我们对于微生物群落以及它们所处的地球化学环境的理解。蛋白质组学的研究提供了不同微生物类群在凋落物分解过程中所起到的作用，对于胞外酶的研究可以揭示微生物量的限制因素、酶与凋落物分解的关系、酶活性与相关蛋白丰度的关系、酶的微生物起源以及落叶层生物与生物地球化学作用之间的关系。微生物蛋白与其生境的时间分布可以为微生物的多样性与其在生物地球化学作用过程中所扮演的角色的研究提供帮助。宏蛋白质组学将从一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：(1)样品预处理：将土壤样品放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，过100目筛子，称取过筛后土壤样品，按质量比1:10加入裂解缓冲液；使其混匀，随后水浴加热处理，涡旋，得到第一悬混液；(2)震荡破碎：按照每0.5mL裂解缓冲液/2颗钢珠的比例将钢珠加入到步骤(1)中得到的第一悬混液，0～4℃下利用研磨机震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎，促使蛋白质充分溶出；离心，收集第一上清液；(4)冷丙酮沉淀：向步骤(3)中得到的第一上清液加入3‑6倍体...

【技术特征摘要】
1.一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：(1)样品预处理：将土壤样品放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，过100目筛子，称取过筛后土壤样品，按质量比1:10加入裂解缓冲液；使其混匀，随后水浴加热处理，涡旋，得到第一悬混液；(2)震荡破碎：按照每0.5mL裂解缓冲液/2颗钢珠的比例将钢珠加入到步骤(1)中得到的第一悬混液，0～4℃下利用研磨机震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；(3)超声提取：将步骤(2)中得到的破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎，促使蛋白质充分溶出；离心，收集第一上清液；(4)冷丙酮沉淀：向步骤(3)中得到的第一上清液加入3-6倍体积的-20℃预冷的丙酮，优选的，加入4倍体积的-20℃预冷的丙酮；在-20℃下静置5小时，高速离心，弃掉溶液，用-20℃的丙酮洗2次，然后加入50μL裂解缓冲液溶解蛋白质得到蛋白溶液；(5)蛋白质酶解：精密称取步骤(4)所得含50μg蛋白质的蛋白溶液，加入单一蛋白酶或者蛋白酶组合，其中加入的蛋白质和每种蛋白酶质量比为20-50:1，优选的，按质量比25:1加入蛋白酶；于37℃孵育过夜得到多肽溶液；(6)肽段的提取和纯化：对于步骤(5)所得多肽溶液，加入分离剂1，涡旋5分钟，然后加入分离剂2，涡旋混匀，离心，静置10分钟，在不扰动沉淀和中间相的情况下，将约90％的含肽段的下层相转移到新的离心管中；再加分离剂3，涡旋混匀后，离心，取下层；合并两次所得肽段溶液；(7)利用固相萃取离心柱对步骤(6)两次所得肽段溶液进行脱盐处理，收集洗出液；经离心浓缩干燥后，用复溶液充分涡旋重新溶解肽段样品，直接上机分析。2.根据权利要求1所述的一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的土壤为包括普通土壤、淤泥、沉积物在内的各种土壤样品。3.根据权利要求1所述的一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的低温破碎为液氮研磨破碎或其他可保持破碎过程中样品温度在零度以下的破碎装置；任选的，所述步骤(1)中的称取过筛后的土壤样品的质量为200-400mg，优选的取300mg土壤样品；任选的，所述步骤(1)和(4)中的裂解缓冲液的配方为：70mM溴化四乙铵、0.5％二乙基二硫代氨基甲酸钠、10mM三(2-羧乙基)膦、30mM二氯乙酰胺、0.5％十二烷基硫酸钠，1M尿素，pH值调至8.0-8....

【专利技术属性】
技术研发人员：张洁，王晓飞，郭睿，
申请(专利权)人：赛思莱厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35