组织移植物制造技术

本发明专利技术涉及生产组织移植物的方法，至少包括步骤：提供凝胶、用至少第一类细胞和/或第二类细胞接种凝胶，以及在所述凝胶中培养第一类细胞和/或第二类细胞，直到通过第一类细胞和/或第二类细胞在凝胶中形成至少一种第一生物结构。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组织移植物
本专利技术涉及含有至少一种生物结构的装置和制造所述装置的方法，所述装置用于治疗性治疗和/或用于体外测试人体或其他哺乳动物组织。例如，所述装置可以用于烧伤、损伤或患病皮肤的皮肤伤口上，并且提供如在正常未损伤皮肤的结构和功能。
技术介绍
人皮肤由三个主要层组成：表皮(最外层)、真皮(中间层)和皮下组织(最深层)。当造成深度创伤(全厚皮肤(full-thicknessskin)创伤)时，例如烧伤事故后，表皮和全部真皮(某些情况下还有皮下组织)受损，并且需要外科手术干预。最佳地通过全厚皮肤自体移植物的方法治疗小型全厚皮肤创伤：从身体的健康部分获得表皮和完整真皮，并且将其移植到伤口上。相反，通过刃厚皮肤(split-thicknessskin)自体移植物(其由表皮以及仅仅非常且不完全的薄层真皮组成)的方法治疗大型全厚皮肤缺陷仍是一个临床上未解决的问题。的确，这样的创伤愈合很差，并且发展成大的、丑陋的并且无功能的疤痕。与刃厚皮肤自体移植物相比，全厚皮肤自体移植物最佳地愈合深度创伤有许多原因。这些原因中的一个在于，在全厚皮肤自体移植物中存在脉管结构，而在刃厚皮肤自体移植物中缺少脉管结构。脉管生物结构(血管和淋巴管)对于人体中的器官是必要的，这是由于其不断地提供氧气和营养物以及免疫细胞贩运(immunecelltrafficking)，它们促成了全部功能和存活。脉管生物结构对移植的器官，甚至对薄的扁平的器官如皮肤是有效的。全厚皮肤移植物中的毛细管仅需要连接于创面床(woundbed)的毛细管，然而在刃厚皮肤移植物的情况下，毛细管需要向移植物内生长以散布于组织。最近，研究和临床证据也表明，由于淋巴管基本上从创伤区域排出了免疫细胞、残骸和过多的流体，淋巴管对皮肤移植物存活可能是必需的。当考虑提供大量全厚皮肤移植物用于治疗大型全厚皮肤缺陷的方式时，会想到含有脉管生物结构的皮肤的组织工程。水凝胶作为支架材料的一个主要优势(与其他类型的支架如胶原蛋白海绵相比)是其作为3D细胞基质的特性。它是高度生物相容的和生物模拟性的，具有低免疫原性(跨物种保守的)，并且可通过能容易地在纤丝网络内在组织间隙接种的细胞自然地改型。然而，水凝胶的机械性能差是在其临床中用作用于组织工程化应用的支架的主要限制。机械稳定性对于基于水凝胶的组织工程化产品的临床应用是必要的，尤其是当这些产品的特征是如在皮肤移植物的情况下的大且薄的物理尺寸时(用于皮肤移植物的临床相关大小是最小50cm2，厚度为小于2mm)。在培养期间和培养之后以及外科手术应用和/或测试期间和之后，要求机械稳定性以允许水凝胶的操作和加工。凝胶的机械稳定性可以通过压实增加。EP0187104公开了压缩胶原蛋白凝胶基质以形成纤维网络用于医学用途。EP1773416公开了在制备用于组织移植物的支架-细胞基质中塑性压缩凝胶的用途。Braziulis等人.2012(胶原蛋白水凝胶的改良的塑性压缩提供用于临床可应用的皮肤替代物的理想基质(ModifiedPlasticCompressionofCollagenHydrogelsProvidesanIdealMatrixforClinicallyApplicableSkinSubstitutes),TissueEngineering:PartC；Vol.18,No.6,2012)报道了用于使基于水凝胶的大的(7×7cm)人真皮-表皮皮肤移植物工程化的改良塑性压缩方法。这些压缩的工程化产品在细胞培养期期间和之后以及在对猪的移植期期间显示了最佳的机械稳定性(Braziulis等人.2011，皮肤工程I：用于在大型动物模型中自体移植的工程化猪真皮-表皮皮肤类似物(SkingineeringI:engineeringporcinedermo-epidermalskinanaloguesforautologoustransplantationinalargeanimalmodel),Pediatr.Surg.Int.(2011)27:241-257、Schiestl等人.,2011，皮肤工程II：在新的猪模型中移植大规模实验室生长的皮肤类似物(SkingeineeringII:transplantationoflarge-scalelaboratory-grownskinanaloguesinanewpigmodel),Pediatr.Surg.Int.(2011)27:249-254)。令人惊讶地，压缩过程没有改变接种于水凝胶中和水凝胶上的细胞的生物特性。
技术实现思路
本专利技术的总体目的是在优选生物相容的、生物可降解的水凝胶基质中和/或水凝胶基质上，生产含有细胞和至少一种生物结构的改进的和机械稳定的组织移植物装置，用于人的临床用途和/或测试。更具体地，目的是开发优选为自体的具有生物结构的真皮-表皮皮肤移植物，用于临床用途和测试。到目前为止，已经产生了用于研究目的的含有血管生物结构的预脉管化(prevascularized)真皮-表皮皮肤替代物。在使预脉管化真皮-表皮皮肤移植物生物工程化以用于治疗皮肤缺陷的预期临床应用方面没有可用的数据。此外，到目前为止，在人毛细淋巴管的工程化方面的有限的数据是可用的，而在预脉管化含有功能性人毛细淋巴管的真皮-表皮皮肤替代物的工程化方面没有可用的数据。在人真皮中，淋巴管在组织液内稳态和免疫细胞贩运中起重要作用。真皮毛细淋巴管展示了宽阔的腔、固着性纤丝以及没有或不完整的基底膜，并且缺少壁细胞(muralcell)覆盖。这些特征使毛细淋巴管能通过吸取和移除过多的组织液对间质液压力响应。在受创伤后，淋巴管内皮也是破裂的；因此，淋巴管的引流能力受到损害。作为结果，组织液出现积累。持续存在的局部间质液以及局部残骸和炎性细胞的延迟移除阻碍了创伤愈合。相反，对淋巴管产生和免疫细胞募集的诱导显示了加速皮肤的再生。本专利技术的第一种实施方式涉及生产组织移植物的方法，至少包括以下步骤：-提供凝胶，-用至少第一类细胞和/或第二类细胞接种凝胶，-在所述凝胶中培养第一类细胞和/或第二类细胞，直到所述第一类细胞和/或第二类细胞在所述凝胶中形成至少一种第一生物结构。也就是说，用一种或多种细胞类型接种凝胶，并且在所述凝胶中和/或所述凝胶上培养细胞直到至少一种生物结构形成。用于本专利技术的方法的凝胶可以是任何3D生物基质，如胶原蛋白水凝胶，优选为I型胶原蛋白水凝胶，或纤维蛋白水凝胶。在生物学中，结构存在于所有组织水平，分层排列从原子和分子水平到细胞、组织、器官、有机体、种群和生态系统水平。出于本专利技术的目的，术语“生物结构”被理解为任何结构/组织/器官，其由存在于人和其他哺乳动物身体/胚胎/胎儿内的多于一个细胞组成，具有一些类型的组织性和/或复杂性和/或功能性。因此，仅随机的一群细胞不会落入该定义内。本申请提供的结果分别显示了在凝胶中和/或凝胶上，形成人脉管生物结构和内皮生物结构的数据。然而，可使用根据本专利技术的系统工程化存在于人或其他哺乳动物身体/胚胎/胎儿内的任何类型的生物结构，例如上皮组织(包括腺组织、胎盘组织和羊膜组织)、脉管组织(血管和淋巴管)、神经组织、结缔组织(包括骨)、毛发、指甲和牙齿，间充质、肌肉、脂肪和所有人或其他哺乳动物的器官和组织。通过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产组织移植物的方法，至少包括以下步骤：‑提供凝胶，‑用至少第一类细胞和/或第二类细胞接种所述凝胶，‑在所述凝胶中和/或所述凝胶上，培养所述第一类细胞和/或所述第二类细胞，直到由所述第一类细胞和/或所述第二类细胞在所述凝胶中和/或所述凝胶上形成至少一种第一生物结构。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产组织移植物的方法，至少包括以下步骤：-提供凝胶，-用至少第一类细胞和/或第二类细胞接种所述凝胶，-在所述凝胶中和/或所述凝胶上，培养所述第一类细胞和/或所述第二类细胞，直到由所述第一类细胞和/或所述第二类细胞在所述凝胶中和/或所述凝胶上形成至少一种第一生物结构。2.根据权利要求1所述的方法，其中，由所述第一类细胞和/或所述第二类细胞在所述凝胶中形成所述至少一种第一生物结构后，将第三类细胞接种于所述凝胶上。3.根据权利要求2所述的方法，其中，在接种所述第三类细胞后，培养所述凝胶，直到在所述凝胶上形成至少一种第二生物结构。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一生物结构是脉管结构，优选是毛细血管和/或毛细淋巴管的脉管丛。5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述第二生物结构是表皮结构。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一类细胞和/或所述第二类细胞和/或所述第三类细胞是哺乳动物细胞，优选是人细胞。7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一类细胞和/或所述第二类细胞和/或所述第三类细胞是自体细胞。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一类细胞和/或所述第二类细胞选自内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、间充质细胞、造血细胞、免疫系统细胞、脂肪组织源性细胞、壁细胞、干细胞、祖细胞、基因修饰细胞的组。9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中，所述第三类细胞选自角质细胞、黑色素细胞、梅克尔细胞、免疫系统细胞、脂肪组织源性细胞、非表皮源性上皮细胞、干细胞、祖细胞、基因修饰细胞的组，优选为角质细胞。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一类细胞是内皮细胞，所述第二类细胞是成纤维细胞，将所述内皮细胞和所述成纤维细胞在所述凝胶中共培养，用于形成所述第一生物结构。11.根据权利要求7所述的方法，其中，所述内皮细胞和所述成纤维细胞在所述凝胶中以成纤维细胞与内皮细胞的比例为至少3:7，优选为至少2:3，更优选为约1:1进行接种和共培养。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一类细胞是选自以下的组的内皮细胞：hBEC和/或hLEC或其混合物，优选为HDMEC；或所述第一类细胞是SVF细胞。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，用所述第一类细胞和/或所述第二类细胞接种凝胶后，压实所述凝胶，优选通过压缩压实所述凝胶。14.根据权利要求13所述的方法，其中，通过用压缩装置压缩来压实所述凝胶。15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在形成所述至少一种第一生物结构之前或之后进行压实所述凝胶。16.根据权利要求2和权利要求13-15中任一项所述的方法，其中，在压实所述凝胶后，用所述第三类细胞接种所述凝胶。17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述凝胶是水凝胶，优选为纤维蛋白水凝胶或胶原蛋白水凝胶，优选为I型胶原蛋白水凝胶。18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，未压缩状态下的凝胶具有第一厚度，进行压实直到所述凝胶在压缩状态下达到，第二厚度是所述第一厚度的1/3～1/20，优选是所述第一厚度的约1/10，其中优选地压缩状态下的凝胶的厚度是约0.7～1mm。19.一种组织移植物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：恩斯特·赖克曼，达妮埃拉·马里诺，阿尼埃兹卡·西尔维娅·克拉尔，
申请(专利权)人：苏黎世大学，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH