一种韭菜未受精子房离体培养方法技术

本发明专利技术属于单倍体培养技术，提供一种韭菜未受精子房离体培养方法，该方法以韭菜未受精子房作为对象，经过子房预处理、接种、转接、生根步骤，最终获得韭菜单倍植株，具体步骤如下：(1)子房预处理(2)接种(3)转接(4)生根。该方法相对于传统方法，培养时间相对缩短，通过优化的培养基和培养方法，均大大提高了成胚数和成胚率。优化生根培养基，使获得的植株生根效果更好，更易成活。通过一些方法的配合，缩短了育种的时间。

In vitro culture method of leek unfertilized sperm chamber

The invention belongs to the haploid culture technology, provides a leek Unfertilized Ovary Culture in vitro, the leek Unfertilized Ovary as object, ovary after pretreatment, inoculation, transfer, rooting steps, finally get the leek haploid plants, the specific steps are as follows: (1) ovary pretreatment (2) inoculation (3) transfer (4) root. Compared with the traditional method, the culture time of this method is relatively shortened, and the number of embryos and the rate of embryo formation are greatly improved by optimizing the culture medium and culture methods. The rooting medium was optimized so that the rooting effect of the obtained plant was better and it was easier to survive. The breeding time was shortened by some methods.

【技术实现步骤摘要】
一种韭菜未受精子房离体培养方法
本专利技术属于单倍体培养技术，具体涉及一种韭菜未受精子房离体培养方法。
技术介绍
韭菜(AlliumtuberosumRottl.exSpr.)原产于中国，属于百合科葱属多年生宿根植物。我国是韭菜的生产大国，对韭菜的需求量大，因此，需要不断培育新品种以达到市场的需求。目前，韭菜新品种培育多采用有性杂交结合系统选育的方法进行，杂交分离后代自交纯合速度慢，每年只能繁殖一个世代，新品种培育速度缓慢，育成一个品种往往需要7—8年时间，限制了韭菜品种更新换代的速度。近年来，随着单倍体育种技术的发展，为韭菜快速育种提供了一种新方法。单倍体育种，在较短时间内能选育出整齐一致的纯系，大大缩短育种年限，还能丰富种质资源，对于选育出亲本自交系、加快育种进程、培育优势杂交组合具有重要的意义。但是，由于韭菜常常雄性不育，花药(小孢子)单倍体培养目前还没有获得的成功的例子。自1976年SanNeoum首先按从未受精子房或胚珠得来的单倍体植株的离体诱导在大麦中获得成功以来，这种方法已应用于多种作物，并认为在花药培养尚未成功的情况下对花药培养是一种选择。传统韭菜一般为同源四倍体(2n＝4X＝36)，未受精子房中卵细胞、助细胞、反足细胞和珠被细胞均具有胚胎发生功能。田惠桥和杨弘(1989)以加入0.5ppmZt和0.1ppmMCPA的MS培养基诱导韭菜子房胚状体分化，分化率最高为48.7％，从培养到获得再生植株共经历65天，分化率较低，历时较长。因此迫切需要研究一种快速、高效获得韭菜单倍体育种技术，使韭菜杂交分离后代快速纯合，育成新的韭菜品种。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种快速、高效通过未受精子房获得韭菜单倍体和纯合体的方法，为韭菜育种提供新的方法。本专利技术目的通过以下方案实现本专利技术提供一种韭菜未受精子房离体培养方法，该方法以韭菜未受精子房作为对象，经过子房预处理、接种、转接、生根步骤，最终获得韭菜单倍植株，具体步骤如下：(1)子房预处理：选择韭菜花蕾，进行消毒处理，剥去花萼、花瓣，取出子房；(2)接种：将子房切片，以切口接触愈伤诱导培养基进行接种，诱导子房形成愈伤组织；其中，愈伤诱导培养基为改良BDS培养基：BDS+2,4-D1.5mg/L+KT1.5mg/L，蔗糖含量10％，pH5.8-6.0；(3)转接：将诱导获得愈伤组织的子房转接于分化培养基中，使愈伤组织分化出芽；其中，分化培养基为改良MS培养基1：MS+5％鲜椰汁+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，pH5.8-6.0；(4)生根：将分化出芽的植株转接于生根培养基中，获得韭菜单倍体植株。其中，生根培养基为改良MS培养基5：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，PH5.8。子房切片厚度一般为1-2mm。在转接分化培养基时，应尽可能轻柔而迅速，保证子房受到最小损伤，这对后面的分化效率是很重要的。鲜椰汁为市售任一品种椰子汁，以去离子无菌水进行稀释调配。2.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(2)进行接种后，进行温度光照诱导处理：4℃预处理24h-48h，然后33℃热激24h，进入25℃暗培养。3.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(3)转接需要在3-5天内完成；转接后，培养温度为24-26℃，光照2500Lux，7h白天/5h黑夜。4.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(4)进行生根培养前，直接将分化出芽的愈伤组织转接于扩增培养基中，其中，扩增培养基为改良MS培养基2：MS+5％鲜椰汁+6-BA2.5mg/L+NAA0.3mg/L，蔗糖含量3％，PH5.8-6.0。5.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(1)中选择的花蕾为花苞张开前2天的花蕾，对应的是小孢子发育为单核中期。花苞开前2天的花蕾，表现为花蕾饱满，花苞苞膜完好。6.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(1)中对子房进行预处理，其方式为：流水冲洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后无菌水冲洗5次以上。7.上述1提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，步骤(4)进行生根后，将苗子接种在0.01％秋水仙素的MS培养基上，蔗糖含量3％，pH5.8，处理3天，然后转接在不含秋水仙素的MS培养基上，获得染色体加倍的韭菜，即2n＝32。8.上述7提供的韭菜未受精子房离体培养方法，其中，加倍后的韭菜幼苗扩大生产进行炼苗，选择幼苗特征为长4—5条根，根长4cm以上；进行炼苗时，设置温室温度24-28℃，湿度75％，光照第1周5000-10000Lux，第二周1.5万—2万Lux。有益效果：1.本专利技术通过优化愈伤组织诱导培养基和诱导处理方式，大大提高了成胚数和成胚率，经过对比试验，无论是何种品种，成胚数最少为78个·蕾-1，成胚率至少为83.8％，相对于传统地的方法，均有明显提高。2.从子房培养到单倍体植株整个获得时间为55-60天左右，相对于传统地65-100天的时间，时间有所缩短，提高了生产效率。本专利技术经过一系列优化方法，填补了目前韭菜单倍体植株培养的空白和局限，为更大规模和深入地进行韭菜育种改造提供基础。附图说明图1经过诱导培养后分化出芽的愈伤组织图2愈伤组织转接于生根培养基中进行生根图3染色体未加倍处理时韭菜单倍体染色体(2n＝16)图4经过秋水仙素处理后韭菜染色体(2n＝4X＝32)具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。实施例11、培养基配制愈伤组织诱导培养基(改良BDS培养基)：BDS+2,4-D1.5mg/L+KT1mg/L，蔗糖含量10％，pH5.8-6.0；分化培养基(改良MS培养基1)：MS+5％鲜椰汁+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，pH5.8-6.0；扩大培养基(改良MS培养基2)：MS+5％鲜椰汁+6-BA2.5mg/L+NAA0.3mg/L，蔗糖含量3％，pH5.8-6.0；改良MS培养基3：MS+0.5ppmZt+0.1ppmMCPA，蔗糖含量10％，pH5.8-6.0；改良MS培养基4：MS+2,4-D1.5mg/L+KT1mg/L，蔗糖含量10％，pH5.8-6.0；生根培养基(改良MS培养基5)：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，PH5.8。鲜椰汁过除菌过滤器。培养基装在三角瓶内灭菌，灭菌(121℃,20min)后倒入预先灭菌(121℃,20min)的培养皿中，待培养基冷凉，备用。2、材料选择2.1品种选择：市售品种，791宽叶雪韭、紫根韭菜、多抗富韭6号。2.2材料获得：花苞开花前2天，花蕾表现为饱满、圆润，花苞苞膜完好，花蕾长度1-2cm。2.3材料处理：1)花蕾取下，进行消毒，流水冲洗5次以上，然后75％酒精浸泡25s，然后0.2％升汞浸泡8min，最后无菌水冲洗5次以上；2)在无菌操作台中，剥去花萼、花瓣，取出子房。3.接种在无菌操作台中，将取出的子房立即进行切片，切片厚度1-2mm。将切口接触改良BDS培养基，接入三角瓶中，每瓶接种9-10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种韭菜未受精子房离体培养方法，其特征在于：该方法以韭菜未受精子房作为对象，经过子房预处理、接种、转接、生根步骤，最终获得韭菜单倍植株，具体步骤如下：(1)子房预处理：选择韭菜花蕾，进行消毒处理，剥去花萼、花瓣，取出子房；(2)接种：将子房切片，以切口接触愈伤诱导培养基进行接种，诱导子房形成愈伤组织；其中，愈伤诱导培养基为改良BDS培养基：BDS+2,4‑D1.5mg/L+KT 1.5mg/L，蔗糖含量10％，pH5.8‑6.0；(3)转接：将诱导获得愈伤组织的子房转接于分化培养基中，使愈伤组织分化出芽；其中，分化培养基为改良MS培养基1：MS+5％鲜椰汁+6‑BA2mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，pH5.8‑6.0；(4)生根：将分化出芽的植株转接于生根培养基中，获得韭菜单倍体植株；其中，生根培养基为改良MS培养基5：MS+6‑BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，PH5.8。

【技术特征摘要】
1.一种韭菜未受精子房离体培养方法，其特征在于：该方法以韭菜未受精子房作为对象，经过子房预处理、接种、转接、生根步骤，最终获得韭菜单倍植株，具体步骤如下：(1)子房预处理：选择韭菜花蕾，进行消毒处理，剥去花萼、花瓣，取出子房；(2)接种：将子房切片，以切口接触愈伤诱导培养基进行接种，诱导子房形成愈伤组织；其中，愈伤诱导培养基为改良BDS培养基：BDS+2,4-D1.5mg/L+KT1.5mg/L，蔗糖含量10％，pH5.8-6.0；(3)转接：将诱导获得愈伤组织的子房转接于分化培养基中，使愈伤组织分化出芽；其中，分化培养基为改良MS培养基1：MS+5％鲜椰汁+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，pH5.8-6.0；(4)生根：将分化出芽的植株转接于生根培养基中，获得韭菜单倍体植株；其中，生根培养基为改良MS培养基5：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，蔗糖含量3％，PH5.8。2.权利要求1所述的韭菜未受精子房离体培养方法，其特征在于：步骤(2)进行接种后，进行温度光照诱导处理：4℃预处理24h-48h，然后33℃热激24h，进入25℃暗培养。3.权利要求1所述的韭菜未受精子房离体培养方法，其特征在于：步骤(3)转接需要在3-5天内完成；转接后，培养温度为24-26℃，光照...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔保建，余汉党，王贞，曹秀敏，马爱锄，王利亚，唐宪超，赵然花，李克寒，王建章，张明，王秋，刘文克，孙彦青，李冠军，黄珊珊，张伟，李冰冰，王雅丽，李延龙，郭柱，赵鹏飞，李秋丽，
申请(专利权)人：平顶山市平丰种业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：河南,41