利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法技术

本发明专利技术涉及兰花繁殖技术领域，具体涉及利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法。本发明专利技术利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法，包括制备无性繁殖花苞片、诱导培养获得不定芽、增殖培养获得大量的不定芽、分化培养、生根培养、炼苗和试管苗移栽步骤。本发明专利技术选取二叶兜被兰的花苞片作为外植体来诱导快速繁殖二叶兜被兰，通过继代培养、分化培养和生根培养，最终获得了大量优质二叶兜被兰试管苗。本发明专利技术提供的方法繁殖的二叶兜被兰试管苗性状稳定，繁殖速率比传统繁殖方法提高80％，成活率提高90％，能解决二叶兜被兰无性繁殖现有技术繁殖率低、繁殖周期长的问题。

The two bag is blue leaf buds and rapid propagation of two leaf Neottianthe is the method

The present invention relates to the technical field of orchid breeding, in particular to the use of two leaf bag is blue bracts and rapid propagation of two leaf Neottianthe is the method. The invention uses the two leaf bag is blue bracts and rapid propagation of two leaf Neottianthe is the method, including the preparation of asexual reproduction, buds induction culture obtained adventitious buds, adventitious buds, proliferation of cultured anddifferentiated culture, rooting, seedling and transplanting steps. The present invention selects two leaf buds blue bag is used as explants to induce rapid propagation of two leaf Neottianthe is, through subculture, differentiation culture and rooting culture, finally obtained a large number of high-quality two leaf Neottianthe is plantlets. The breeding method provided by the invention of the two leaf Neottianthe is plantlets were stable, the reproduction rate is 80% higher than traditional breeding methods, the survival rate increased by 90%, to solve the two leaf Neottianthe is asexual reproduction prior low reproductive rate, long reproductive cycle problems.

【技术实现步骤摘要】
利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法
本专利技术属于兰花繁殖
，具体涉及利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法。
技术介绍
兰花以其形态优美别致、花色艳丽、色泽丰富、花期长，被称为花中之王。二叶兜被兰更是野生兰花之精品。二叶兜被兰为兰科兜被兰属植物，植株高4-24厘米。块茎圆球形或卵形。茎直立或近直立，其上生有2枚近似对生的叶。叶近平展或直立伸展，叶片卵形、卵状披针形或椭圆形，叶上面有时具少数或多而密的紫红色斑点。二叶兜被兰具有很高的园艺和草药价值。繁殖方式为分株繁殖，而且需要每隔三年才可分株一次，分株后每丛至少要保存5个连结在一起的假球茎，这种方法的困难是时间周期长，符合要求的假球茎少、难度大、成功率低。常规的繁殖方法难以满足市场需求，而组织培养是快速繁殖二叶兜被兰的最有效途径。1960年，Morel提出了离体无性繁殖兰花的方法。随着兰花的推广，对兰花快繁体系的研究也逐渐深入。各种无性繁殖技术成为研究的热点。但是，由于生物的种间差异，广义上可适用于兰花无性繁殖的技术，具体到二叶兜被兰上并不一定可行，因此，二叶兜被兰的快速繁殖研究仍然是亟待解决的问题，其对保护兜被兰属植物野生资源和促进在园林中应用均具有现实意义。中国专利技术CN104920222A公开了兰花的快速繁殖方法，包括如下步骤:选取兰花植株的球茎上的芽作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用水冲，40-50min后，然后表面消毒，最后用无菌水冲洗后，放MS+5.Omg/L的6卡氨基腺嘌呤，加50g/L的蔗糖，加7g/L的琼脂、PH为5.5的培养基中培养诱导成苗，培养条件为:18-22℃、光照强度1200-1400Lux，光周期为13h/d，待小苗长到2～3片叶、叶长6～7cm时，用剪刀将叶片剪为0.9～1.1cm长的叶片。但上述专利技术还不能在保证存活率和兰花的品质前提下，快速的进行繁殖且能减少成本和减少污染。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有技术存在的问题，本专利技术提供的二叶兜被兰花苞片为外植体的组培快速繁殖方法，采用本专利技术的方法能够在短期内获得大量优质的试管苗，解决野生二叶兜被兰品种不能规模化生产和大面积应用存在问题。为解决上述问题，本专利技术提供的利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法，包括如下步骤：(1)外植体制备步骤：选取二叶兜被兰植株的花苞片作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用纯蒸水冲洗30min后，在无菌条件下，用1.5％的次氯酸钠表面消毒15min，然后用75％酒精表面消毒30s，最后用无菌水冲洗后备用；(2)诱导培养获得不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，再添加浓度为0.5-1.0mg/L的6-BA、浓度0.3-0.5mg/L的2，4-D、浓度为0.5-2.0mg/L的KT、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的诱导培养基，将步骤(1)中准备的花苞片消毒后，置于诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：温度在17-23℃，暗光培养60-65天，直至获得不定芽；(3)增殖培养不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，添加浓度为0.5-1.0mg/L的6-BA、浓度为1.0-3.0mg/L的KT、浓度为0.2-0.4mg/L的2，4-D、浓度为30g/L的蔗糖和浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的增殖培养基，将步骤(2)中培养的不定芽置于增殖培养基中进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，直至获得大量不定芽；(4)分化培养步骤：以MS培养基为基本培养基，添加浓度8.0-10.0mg/L的6-BA、和浓度0.1-0.3mg/L的NAA、浓度30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的分化培养基，将步骤(3)培养的愈伤组织置于分化培养基中培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，直至不定芽分化成叶长为3-4cm的芽苗；(5)生根培养步骤：以1/2MS培养基为基本培养基，30g/L蔗糖和5g/L硅藻粉、2g活性炭，制备成PH为5.8的生根培养基，将步骤(4)中培养的芽苗取单苗置于生根培养基中生根培养，培养条件同步骤(4)，直至芽苗生根获得二叶兜被兰生根苗；(6)炼苗步骤：待步骤(5)培养的苗根长到1-3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6-8天；(7)试管苗移栽步骤：试管苗移栽基质为醋糟和蛭石，基质移栽前进行高温消毒，取出步骤(6)培养的小苗用水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分，即移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在85％-95％、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃，40天后进入后期种植管理。优选的技术方案，所述步骤(2)中再添加浓度为0.75mg/L或0.8mg/L的6-BA、浓度为0.4mg/L的2，4-D、浓度为2.0mg/L的KT、浓度为30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成诱导培养基的PH为5.8。优选的技术方案，所述步骤(3)中添加6-BA的浓度为0.8mg/L、KT的浓度为2.0mg/L、2，4-D的浓度为0.3mg/L、蔗糖的浓度为30g/L和硅藻粉的重量百分比6g/L和抑菌剂，其中增殖培养基的PH为5.8。优选的技术方案，所述步骤(4)中添加6-BA的浓度9.0mg/L、NAA的浓度0.2mg/L的、蔗糖的30g/L、硅藻粉的浓度6g/L和抑菌剂，制成分化培养基的PH为5.8，培养条件为：22℃。优选的技术方案，所述步骤(7)中的试管苗移栽基质中的醋糟和蛭石含量至少为80％，其中醋糟和蛭石的重量比为1:1或1.5:1。优选的技术方案，所述试管苗移栽基质还包括10％以上的泥岩和珍珠岩，其中的泥岩：珍珠岩的重量比为3～5：1.5。优选的技术方案，所述蛭石进行碫烧处理，所述碫烧处理的温度范围为850°～880°，进行碫烧15～20分钟后，用常温水或加入食醋的水作为介质，进行快速冷却至常温。优选的技术方案，所述蛭石的颗粒度为15mm～25mm，所述食醋与水的质量百分比为5％。优选的技术方案，所述后期种植管理包括对二叶兜被兰幼苗进行干湿间隔补水管理步骤，所述干湿间隔补水管理步骤，包括在10天～15天的范围内绝水管理，进行绝水管理后的次日，再进行供水灌浇，供水灌浇的次数间隔保持2小时1次，共计浇灌3～4次。优选的技术方案，所述绝水管理期为14天。本专利技术提供的利用野生二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法与现有技术相比具有以下有益效果：(1)二叶兜被兰首次采用采用组织培养技术进行无性繁殖，繁殖率比分株繁殖提高80％。(2)在兰科植物组织培养中独创性的采用花苞片作为外植体诱导不定芽试管苗，比采用其它外植体生成原球茎在诱导芽和生根时间缩短三分之一。(3)采用硅藻粉结合抑菌剂代替琼脂粉培养成本节省三分之二，可使污染率降低90％。(4)试管苗移栽基质使用醋糟+蛭石比分株繁殖的成活率提高90％。具体实施方式下文对本专利技术的具体实施例进行详细说明。实施例1本专利技术提供的利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法，包括如下步骤：(1)外植体制备步骤：选取二叶兜被兰植株的花苞片作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用纯蒸水冲洗30min后，在无菌条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体制备步骤：选取二叶兜被兰植株的花苞片作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用纯蒸水冲洗30min后，在无菌条件下，用1.5％的次氯酸钠表面消毒15min，然后用75％酒精表面消毒30s，最后用无菌水冲洗后备用；(2)诱导培养获得不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，再添加6‑BA的浓度为0.5‑1.0mg/L、2，4‑D的浓度0.3‑0.5mg/L、KT的浓度为0.5‑2.0mg/L、蔗糖的浓度为30g/L、硅藻粉的浓度为6g/L和抑菌剂，制成PH为5.8的诱导培养基，将步骤(1)中准备的花苞片消毒后，置于诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：温度在17‑23℃，暗光培养60‑65天，直至获得不定芽；(3)增殖培养不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，添加6‑BA的浓度为0.5‑1.0mg/L、KT的浓度为1.0‑3.0mg/L、2，4‑D的浓度为0.2‑0.4mg/L、浓度为30g/L的蔗糖和浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的增殖培养基，将步骤(2)中培养的不定芽置于增殖培养基中进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，直至获得大量不定芽；(4)分化培养步骤：以MS培养基为基本培养基，添加浓度8.0‑10.0mg/L的6‑BA、和浓度0.1‑0.3mg/L的NAA、浓度30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的分化培养基，将步骤(3)培养的愈伤组织置于分化培养基中培养，培养条件是：17‑23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，直至不定芽分化成叶长为3‑4cm的芽苗；(5)生根培养步骤：以1/2MS培养基为基本培养基，30g/L蔗糖和5g/L硅藻粉、2g活性炭，制备成PH为5.8的生根培养基，将步骤(4)中培养的芽苗取单苗置于生根培养基中生根培养，培养条件同步骤(4)，直至芽苗生根获得二叶兜被兰生根苗；(6)炼苗步骤：待步骤(5)培养的苗根长到1‑3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6‑8天；(7)试管苗移栽步骤：试管苗移栽基质为醋糟和蛭石，基质移栽前进行高温消毒，取出步骤(6)培养的小苗用水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分，即移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在85％‑95％、温度20‑25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17‑20℃，40天后进入后期种植管理。...

【技术特征摘要】
1.利用二叶兜被兰的花苞片快速繁殖二叶兜被兰的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)外植体制备步骤：选取二叶兜被兰植株的花苞片作为外植体，用洗洁精刷洗干净并用纯蒸水冲洗30min后，在无菌条件下，用1.5％的次氯酸钠表面消毒15min，然后用75％酒精表面消毒30s，最后用无菌水冲洗后备用；(2)诱导培养获得不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，再添加6-BA的浓度为0.5-1.0mg/L、2，4-D的浓度0.3-0.5mg/L、KT的浓度为0.5-2.0mg/L、蔗糖的浓度为30g/L、硅藻粉的浓度为6g/L和抑菌剂，制成PH为5.8的诱导培养基，将步骤(1)中准备的花苞片消毒后，置于诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为：温度在17-23℃，暗光培养60-65天，直至获得不定芽；(3)增殖培养不定芽步骤：以MS培养基为基本培养基，添加6-BA的浓度为0.5-1.0mg/L、KT的浓度为1.0-3.0mg/L、2，4-D的浓度为0.2-0.4mg/L、浓度为30g/L的蔗糖和浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的增殖培养基，将步骤(2)中培养的不定芽置于增殖培养基中进行增殖培养，培养条件同步骤(2)，直至获得大量不定芽；(4)分化培养步骤：以MS培养基为基本培养基，添加浓度8.0-10.0mg/L的6-BA、和浓度0.1-0.3mg/L的NAA、浓度30g/L的蔗糖、浓度为6g/L的硅藻粉和抑菌剂，制成PH为5.8的分化培养基，将步骤(3)培养的愈伤组织置于分化培养基中培养，培养条件是：17-23℃、光照强度为1000—1500Lux、光周期为15h/d，直至不定芽分化成叶长为3-4cm的芽苗；(5)生根培养步骤：以1/2MS培养基为基本培养基，30g/L蔗糖和5g/L硅藻粉、2g活性炭，制备成PH为5.8的生根培养基，将步骤(4)中培养的芽苗取单苗置于生根培养基中生根培养，培养条件同步骤(4)，直至芽苗生根获得二叶兜被兰生根苗；(6)炼苗步骤：待步骤(5)培养的苗根长到1-3cm时，将培养瓶的封口膜打开，炼苗6-8天；(7)试管苗移栽步骤：试管苗移栽基质为醋糟和蛭石，基质移栽前进行高温消毒，取出步骤(6)培养的小苗用水洗净根部的培养基，稍晾干表面的水分，即移栽入消毒后的基质中，然后搭建拱棚，将拱棚湿度保持在85％-95％、温度20-25℃，移栽10天后逐渐降低温度至17-20℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：王培军，薛斌，方岩，夏罗宏，葛坤，
申请(专利权)人：太原学院，
类型：发明
国别省市：山西,14