一种鉴别MG 6/85株的套式PCR检测方法技术

本发明专利技术适用于MG快速检测技术领域，提供了一种鉴别MG 6/85株的套式PCR检测方法，通过参考MG S6株和MG 6/85株的mgc2基因序列设计合成两对套式PCR特异性引物，然后提取样品DNA并以其为模板，利用外套引物进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR产物为模板，进行第二轮内套引物的PCR扩增，最后将扩增产物进行电泳检测。本发明专利技术既可鉴别使用MG 6/85株疫苗免疫的父母代种鸡及其鸡胚和后代商品肉鸡中的MG野毒株与MG 6/85株，又可以检测到家禽样品中极微量的MG感染，并且具有良好的特异性，可直接应用于家禽MG检测及防治工作中。

A nested PCR method for identification of MG 6/85 strains

The invention is applicable to the field of rapid detection technology of MG, provides a set of PCR MG 6/85 strain differential detection method, by reference to the MG S6 strain and MG 6/85 strain mgc2 gene sequence designed and synthesized two pairs of nested PCR primers, and then extracted DNA samples and used as templates for the first round PCR amplification using primer coat, then the first round PCR products as template, the second round of the inner primer PCR amplification, the amplified products were detected by agarose gel electrophoresis. The invention can be used to identify MG 6/85 strain vaccine and its parent breeders and chicken broiler progeny of MG wild strain and the MG 6/85 strain, and can detect trace amount of MG infected poultry samples, and has good specificity and can be directly applied to MG detection and prevention and control of poultry in.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别MG6/85株的套式PCR检测方法
本专利技术涉及MG快速检测
，尤其涉及一种鉴别MG6/85株的套式PCR检测方法。
技术介绍
目前，用于检测鸡毒支原体(MG)的方法主要包括分离培养法、免疫荧光法、核酸探针法和PCR法。传统分离培养法费时，操作复杂，对技术要求高，无法快速鉴别MG强、弱毒株，毒力的测定要通过鸡胚接种和SPF鸡感染等致病性试验，费时、成本比较高，无法满足生产实际的需要，除非在条件具备的实验室作特殊的检测外，一般不将分离培养作为MG检测方法；免疫荧光法适用于MG急性感染期检测，此时患病禽体内存在大量的病原。但患病禽在受到抗生素治疗后或转为慢性感染时，血清阳性禽支原体数量不足以用免疫荧光技术检出而易出现假阴性；核酸探针法虽然简单、灵敏，但各种类型支原体之间常有交叉反应，易出现假阳性，影响试验的准确性。PCR技术不但可以克服支原体培养难、易产生交叉反应的缺点，还具有敏感性高、特异性强的特点，而且不需要样品中必须含有活着的MG。但普通PCR方法虽然操作简便但由于其检测的灵敏度有限，极易出现假阴性，影响对样品感染MG情况的客观判断。近年来发展迅速的实时荧光定量PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别MG 6/85株的套式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、引物设计；对MG的mgc2基因序列进行同源性分析，参考MG S6株和MG 6/85株的mgc2基因序列设计合成特异性引物，包括外套引物和内套引物，引物序列如下：外套引物：上游引物mgc201‑F：5’‑TTTTATCCAGTAGTGGGTGC‑3’；下游引物mgc201‑R：5’‑TTATCTAGGTCCATTTTGTG‑3’；内套引物：上游引物mgc202‑F：5’‑CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACA‑3’；下游引物mgc202‑R：5’‑TAAACCCACCTCCAGCTTTATTTCC‑3’；B、...

【技术特征摘要】
1.一种鉴别MG6/85株的套式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、引物设计；对MG的mgc2基因序列进行同源性分析，参考MGS6株和MG6/85株的mgc2基因序列设计合成特异性引物，包括外套引物和内套引物，引物序列如下：外套引物：上游引物mgc201-F：5’-TTTTATCCAGTAGTGGGTGC-3’；下游引物mgc201-R：5’-TTATCTAGGTCCATTTTGTG-3’；内套引物：上游引物mgc202-F：5’-CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACA-3’；下游引物mgc202-R：5’-TAAACCCACCTCCAGCTTTATTTCC-3’；B、样品DNA提取；C、设置PCR反应条件；外套引物反应条件如下：反应体系：10×PCRbuffer2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.0μL、5U/μLTaq酶0.25μL、10pmol/μL上下游引物各1.0μL、样品DNA1.0μL，加水补齐至25.0μL；反应程序：94℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环，72℃延伸10min；内套引物反应条件如下：反应体系：10×PCRbuffer2.5μL、2.5mmol/LdNTP2.0μL、5U/μLTaq酶0.25μL、10pmol/μL上下游引物各1.0μL、第1轮PCR扩增产物1.0μL、加水补齐至25.0μL；反应程序：94℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环，72℃延伸10min；D、套式PCR扩增；以样品DNA作为模板，利用外套引物mgc201-F和mgc201-R进行第一轮PCR扩增，再以第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮内套...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋兆峰，徐斌，迟灵芝，杨明彩，李婧，朱应平，
申请(专利权)人：隋兆峰，
类型：发明
国别省市：山东,37