一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，包括以下步骤：1）配制幽门螺杆菌培养基；2）将培养基加入无菌细胞培养瓶制成斜面；3）将胃黏膜上皮细胞在已形成斜面的培养瓶中培养贴壁；4）取幽门螺杆菌48h菌液离心后用细胞培养液重悬；5）将重悬菌液加入至已有贴壁细胞和斜面培养基的培养瓶中培养，每天计数活菌量并观察细胞形态学变化。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供了一种全新幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养方法。在新体系中，幽门螺杆菌正常生长，持续刺激贴壁细胞产生病变，起到很好模拟感染人胃黏膜时的状况。解决了传统法中直接加入幽门螺杆菌，因培养液不适宜于其生长而造成衰退或死亡，难以有效刺激细胞的问题。

Method for CO culturing Helicobacter pylori and gastric mucosal epithelial cell

The invention discloses a method for Helicobacter pylori and gastric mucosal epithelial cells were cultured, which comprises the following steps: 1) the preparation of Helicobacter pylori culture medium; 2) the culture medium adding sterile cell culture bottle made of an inclined surface; 3) the gastric mucosal epithelial cells in culture flask culture has formed the 4 inclined wall;) from Helicobacter pylori 48h bacteria liquid after centrifugation was resuspended in cell culture flasks; 5) will re suspended bacteria liquid added to existing adherent cells and slant medium, day counting of viable bacteria and changes in cell morphology. The invention has the advantages that the invention provides a novel co culture method of Helicobacter pylori and gastric mucosal epithelial cells. In the new system, the normal growth of Helicobacter pylori, continuous stimulation of adherent cells to produce lesions, a good simulation of human gastric mucosa. It has solved the problem that the direct addition of Helicobacter pylori in traditional method causes the decline or death because the culture medium is not suitable for its growth, and it is difficult to stimulate the cell effectively.

【技术实现步骤摘要】
一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法
本专利技术涉及细菌和细胞培养方法
，具体涉及一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法。
技术介绍
幽门螺杆菌是在1983年发现的一种螺杆状的革兰阴性微需氧菌。它可在人胃黏膜上皮细胞定植，引起胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等多种疾病。由于幽门螺杆菌感染的动物模型较难建立，因此通过体外幽门螺杆菌对培养的胃黏膜上皮细胞的致病作用研究是探讨幽门螺杆菌致病机制的重要模型。建立科学有效的幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养模型显得十分重要。由于幽门螺杆菌在机体内对细胞的致病是较长期作用的结果，因此要求建立的体外共培养模型中幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞较长时间共存。传统的共培养方法主要是：先在细胞培养瓶中用细胞培养液培养细胞，待细胞贴壁后再在培养液中加入一定浓度的幽门螺杆菌悬液，待两者相互作用一段时间后再进行后续相关研究。但这种方法主要有以下缺点：（1）将幽门螺杆菌加入至细胞培养液中后，因细胞培养液不适宜于幽门螺杆菌的生长，使其生理状态发生显著变化，短时间内活力明显下降，至24h内全部衰退死亡，这种频临死亡或已经死亡的幽门螺杆菌对贴壁细胞的致病作用难以反映在感染人的状况下，人胃内增殖活跃状态的幽门螺杆菌对胃黏膜细胞的致病作用，对研究结果产生很大影响。（2）为维持活的幽门螺杆菌刺激贴壁细胞，传统法中需要每隔一天重复加入幽门螺杆菌至培养体系中，造成工作程序繁琐，且活菌数量的变化势必会造成其对细胞作用的波动，同样不利于实验研究。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种全新幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，在正常的细胞培养瓶中加入适宜幽门螺杆菌生长的斜面固体培养基，以此保证幽门螺杆菌的生存，同时细胞培养液可保证胃黏膜细胞的正常生长，二者培养后产生相互作用，解决了幽门螺杆菌体外培养致细胞病变实验研究中因幽门螺杆菌生理状态差异和活菌数量波动对实验结果造成的影响，以及需多次加入细菌的工作繁琐问题。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，包括以下步骤：1）配制用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基并以高温高压湿热灭菌，待培养基冷却至50℃-60℃时，加入葡萄糖溶液和新生小牛血清，充分混匀，得到幽门螺杆菌培养基；2）取步骤1）得到的尚未凝固的幽门螺杆菌培养基10ml，加入50ml无菌细胞培养瓶中（若是玻璃材质类的非一次性的需要先进行高温高压湿热灭菌，一次性的塑料材质的培养瓶则不需要），并使细胞培养瓶的下底面与水平面成30度角，待培养基冷却凝固在瓶底形成斜面后，水平或竖直放置培养瓶备用；如图1所示，细胞培养瓶的底部形成一个专门用来培养幽门螺杆菌的固体斜面，其面积约为20cm2，此时细胞培养瓶底面尚剩余约18cm2面积尚未被固体斜面全覆盖；3）取含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液3ml加入至步骤2）得到的细胞培养瓶中（图2），将细胞培养瓶水平放置入细胞培养箱中，10%CO2、37℃培养24h，使胃黏膜上皮细胞贴壁；4）取已经培养了48h处于稳定期的幽门螺杆菌菌液1ml进行离心，离心转速为800rpm，离心时间为5min，弃去上清后加入细胞培养液1ml重悬，得到重悬菌液；5）将步骤4）得到的重悬菌液加入至步骤3）得到的胃黏膜上皮细胞已经贴壁的细胞培养瓶中，再将细胞培养瓶放入专用于幽门螺杆菌培养的培养箱中继续培养，培养条件：37℃、湿度90%、微需氧气体环境（5%O2、10%CO2和85%N2），每天计数培养瓶液体中幽门螺杆菌的活菌量并观察细胞的形态学变化，收集作用后的细胞和细菌用于后续相关研究。进一步的，上述的一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，所述步骤1）中，用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基的制备方法具体为：称取哥伦比亚琼脂基础粉末4.25g于三角瓶中，加入ddH2O85ml，塞入瓶塞后高温高压湿热灭菌，待固体培养基冷却至50℃-60℃时，加入5ml10%葡萄糖注射液，使葡萄糖的终浓度以质量体积比计为0.5%，再加入10ml的新生小牛血清，使新生小牛血清的终浓度以体积比计为10%，充分混匀后得到幽门螺杆菌培养基。进一步的，上述的一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，所述步骤1）中，高温高压湿热灭菌的温度为121℃，时间为15min。进一步的，上述的一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，所述步骤3）中，含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液的制备方法具体为：弃去培养好的已贴壁达90%的胃黏膜上皮细胞的培养液，加入2mlPBS清洗3次后，弃去PBS，加入2ml0.25%的胰蛋白消化酶，消化5min后加入1ml的完全培养基终止消化。完全培养基的含量配比按照体积比计为高糖型的DMEM90%，新生小牛血清10%，即100ml的完全培养基含有90ml的DMEM和10ml的新生小牛血清。吸取上述胰蛋白酶消化液和完全培养基的混合液以转速800rpm离心5min后，弃去上清，吸取1ml的完全培养基吹打混匀沉淀，另取5ml的完全培养基，将已经吹打混匀的含细胞的培养液逐滴加入，使细胞的浓度达到5×104个/ml，即得到含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，在培养瓶中加入幽门螺杆菌斜面培养基后，进行的细胞贴壁实验证明，加入的胃黏膜上皮细胞经过培养后，观察到细胞在培养瓶的下底面仍正常贴壁生长，细胞形态正常，与在普通细胞培养瓶的下底面贴壁比较无差异。说明幽门螺杆菌斜面培养基的加入没有对细胞生长产生影响。另外，由于受细胞的贴壁因子与固体斜面不相容等因素影响，胃黏膜上皮细胞没有在斜面培养基表面形成贴壁生长，保证了幽门螺杆菌生长。活菌计数发现，在全新改良的幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养体系中，幽门螺杆菌可持续存活，活菌数量经历1天的迟缓适应期后，生长代谢活跃，大量增殖，从第4天开始维持较为稳定的状态可达6天（图3），可以很好保证持续提供幽门螺杆菌，与贴壁的细胞长时间充分接触，发挥致病作用。逐日观察细胞的变化发现，胃黏膜上皮细胞在受幽门螺杆菌的作用后，产生了显著的细胞病变效应，空泡样变化明显，符合实验预期。而且，与传统法幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养法比较，本专利技术提供的方法在相同时间内细胞病变效应更明显。活菌数量的稳定存在，避免了重复加入幽门螺杆菌的工作的繁琐。附图说明图1显示为本专利制作的在细胞培养瓶底部形成的用来培养幽门螺杆菌的固体斜面。其中A：为普通细胞培养瓶；B：为细胞培养瓶底部形成的用来培养幽门螺杆菌的固体斜面；C：表示该处斜面的角度为30°。图2显示为已经形成固体斜面的细胞培养瓶中再加入传统细胞培养液。其中A：为普通细胞培养瓶；B：为细胞培养瓶底部形成的用来培养幽门螺杆菌的固体斜面；C：表示该处斜面的角度为30°；D：加入的细胞培养液。图3显示为初始接种（接种量为103CFU/ml）幽门螺杆菌至仅含斜面的细胞培养液中时，细胞培养液中的活菌数变化（0-1天为幽门螺杆菌的适应期；1.5-3天为对数期；4-9天为稳定期；10-13天为衰亡期）。图4显示为当初始接种量不同时，幽门螺杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）配制用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基并以高温高压湿热灭菌，待固体培养基冷却至50℃‑60℃时，加入葡萄糖溶液和新生小牛血清，充分混匀，得到幽门螺杆菌培养基；2）取步骤1）得到的幽门螺杆菌培养基10ml，加入到50ml无菌细胞培养瓶中，并使细胞培养瓶的下底面与水平面成30度角，待培养基冷却凝固在瓶底形成斜面后，水平或竖直放置培养瓶备用；3）取含胃黏膜上皮细胞5×10

【技术特征摘要】
1.一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）配制用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基并以高温高压湿热灭菌，待固体培养基冷却至50℃-60℃时，加入葡萄糖溶液和新生小牛血清，充分混匀，得到幽门螺杆菌培养基；2）取步骤1）得到的幽门螺杆菌培养基10ml，加入到50ml无菌细胞培养瓶中，并使细胞培养瓶的下底面与水平面成30度角，待培养基冷却凝固在瓶底形成斜面后，水平或竖直放置培养瓶备用；3）取含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液3ml加入至步骤2）得到的细胞培养瓶，将细胞培养瓶水平放置入细胞培养箱中，10%CO2、37℃培养24h，使胃黏膜上皮细胞贴壁；4）取已经培养了48h处于稳定期的幽门螺杆菌菌液1ml进行离心，离心转速为800rpm，离心时间为5min，弃去上清后加入细胞培养液1ml重悬，得到重悬菌液；5）将步骤4）得到的1ml重悬菌液加入至步骤3）得到的胃黏膜上皮细胞已经贴壁的细胞培养瓶中，再将细胞培养瓶放入专门用于幽门螺杆菌培养的培养箱中继续培养，培养条件：37℃、湿度90%、微需氧气体环境，即气体环境含按照体积百分比计的5%O2、10%CO2和85%N2，之后每天计数培养瓶液体中幽门螺杆菌的活菌量并观察细胞的形态学变化，收集作用后的细胞和细菌。2.根据权利要求1所述的一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，其特征在于，所述步骤1）中，用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩俭，王礼，彭琦，孙旭冬，任弟娟，张富花，徐媛媛，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62