清除病毒的方法技术

生产基本无病毒免疫球蛋白尤其是抗Ｄ免疫球蛋白的方法，以及所得产品。具体地说，本发明专利技术提供在高离子强度缓冲液中用诸如聚山梨酸酯８０的赋形剂超微过滤抗Ｄ免疫球蛋白的方法。附加步骤包括用渗滤浓缩抗Ｄ蛋白和降低赋形剂浓度。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利申请98811286.8，“”的分案申请。 专利
本专利技术所属领域为在纯化、减少或清除病毒的过程中，通过小孔径排阻滤膜(filter)回收大蛋白类物质。通过大小排阻将病毒与大生物分子(例如γ球蛋白)分离的障碍在于难以令大的球蛋白通过所需小孔径滤膜以供制药或诊断性应用。用本专利技术方法从蛋白分子中清除病毒可得到基本无病毒的产品。
技术介绍
在纯化、减少或清除病毒的过程中，通过小孔径排阻滤膜(filter)回收大蛋白类物质是目前制药和诊断行业中的重要问题(参见Roberts，P.，Vox Sang，1995；6982-83)。通过大小排阻将病毒与大生物分子(例如单克隆或多克隆γ球蛋白)分离的障碍在于难以令大的球蛋白通过12-15nm孔径的排阻滤膜。如果要从高分子量产品中清除小的无包膜病毒时，这一问题特别突出。该过程的复杂性还在于，欲回收的蛋白类物质例如免疫球蛋白会形成二聚体和三聚体，它们很难或根本就不能通过滤膜。 孔径越小，膜截留病毒颗粒的效果越好。然而，随着孔径的减小，膜允许除病毒产品自由通过的能力随之下降。对所有的除病毒技术来说，每一种应用都必须针对每一种产品和每一种病毒进行评价。如果需要清除小的无包膜病毒，可能必须使用孔径小于35nm，更好的是12-30nm之间的病毒滤膜，但这不能用于高分子量的产品或会形成二聚体和三聚体的产品。 上述Roberts的文献中描述了这一问题，其中谈到，虽然标称截留值为70、160kD，孔径15、35、40、50和70nm的滤膜可用于清除小病毒和朊病毒，但大分子量产品例如免疫球蛋白(IgG，150kD)和VIII因子(350kD)只能通过孔径更大的滤膜。 本专利技术方法包括免疫球蛋白药剂的过滤和病毒清除。 为了防止新生儿溶血病，给母亲注射人源Rho(D)免疫球蛋白。此类产品之一是RhoGAM，由本专利技术的受让人出品，它防止未受免疫的Rho(D)阴性母亲“来自”Rho(D)阳性婴儿红细胞上的Rho(D)抗原产生应答，由此发挥其作用。这样，通过防止母亲产生抗Rho(D)抗体，避免了她的Rho(D)阳性婴儿患新生儿溶血病。虽然，目前用Cohn醇分离法成功生产得这一产品，但数位研究者曾试图用其他方法来生产类似产品，以期经济地获得更优良的产品，减少对血浆的大量需求。这样的研究性努力可参见Hoppe等的报道“预防Rh免疫，用离子交换层析的生产静脉注射用IgG-抗Rh改良法”，Vox Sang，25308-316(1973)，以及Friesen等的“离子交换柱制备和静脉注射用的Rh免疫球蛋白特性分析”，Jounal ofApplied Biochemistry，3，164-175(1981)。 德国的Hoppe和加拿大的Friesen都将DEAE-Sephadex层析柱与磷酸盐缓冲洗脱液联用。Hoppe的含抗D血浆来自通过了至少6个月HB Ag试验室检测的志愿者，血浆被临时保存。所以，Hoppe使用了较安全的无感染血浆作为起始原料。然而，他没有进行其他检测以测定DEAE-Sephadex去除乙肝表面抗原的效果。相反，Hoppe考虑的是去除凝聚体和分离抗体浓度较高的完整的、免疫电泳纯IgG。Friesen所做的则是对Hoppe方法的改良，以开发出供加拿大使用的静脉用Rh IgG。和Hoppe一样，Friesen对每一份Rh血浆进行HB AG检测以剔除阳性供体。Friesen使用Abbort Laboratories，North Chicago，ILL的放射性免疫分析试剂盒(Ausria I试剂盒)。目前，该测试仍被认为是最灵敏的试验之一，并被用于后文所述的本专利技术中。Friesen称，临床试验显示，用DEAE-Sephadex树脂/磷酸盐缓冲液组合生产的物质能够有效而安全的防止Rh免疫。然而，Friesen的报道中没有测定DEAE-Sephadex树脂/磷酸盐缓冲液组合清除血浆样品中乙肝表面抗原的效果。至少从美国政府的角度来看，这是非常重要的，因为用于筛选供体血浆样品的放射性免疫分析试验不能检测出浓度再低两三个数量级的HB AG颗粒，而这样的浓度仍可能具有感染性。正是因为用这种方法生产的制剂可能具有感染性，所以，美国政府在批准用固相法生产的可注射免疫球蛋白产品时特别严格。 RhoGAM(人)Rho(D)免疫球蛋白是第一个成功地预防性抑制抗体介导的免疫的特异性抗体。RhoGAM是一种IgG免疫球蛋白溶液，所含抗Rho(D)的剂量为每剂抗Rho(D)活性300微克。可在合适的时候将RhoGAM给予未经免疫的Rho(D)阴性孕妇，防止她的Rho(D)阳性后代患病。所述的疾病为新生儿溶血病，更具体的说是胎儿Rh成红细胞增多症。 本专利技术受让人还出售一种较低剂量的抗Rho(D)，MICRhoGAM(人)Rho(D)免疫球蛋白小剂型(50微克抗Rho(D))，治疗妊娠12周或更早时流产的妇女。全剂量保护接受者抗高至15ml的Rho(D)阳性红细胞，小剂量则提供抗高至2.5ml的Rho(D)阳性红细胞的保护。RhoGAM被用于妊娠26至28周时的产前预防。其它适应症包括妊娠各阶段的继续妊娠的先兆性流产，在妊娠13周或之后发生的流产或妊娠终止，腹部创伤或基因羊膜穿刺，绒膜绒毛取样(CVS)和经皮脐带血取样(PUBS)。 FDA和生物部批准使用的多数免疫球蛋白类注射物质目前是用哈佛大学E.Cohn博士40年代开发的醇分离法生产的，参见Cohn等，J.Am.Chem.Soe.68，459(1946)。与该方法联用的是用目前最灵敏的检测方法仔细挑选检测肝炎感染性、HIV及其它血液携带病原呈阴性的血浆，该方法应用的如此之久，以至于美国政府只承认用该方法所得制剂是安全的。无数的产品接受者没有被感染，这就可以证明该方法所得产品的确安全。 有几种从人血浆中分离γ球蛋白的常规方法值得注意Baumstark等，“从人血清中分离7Sγ球蛋白的制备方法”，Archives of Biochemistry and Biophysics，108，514-522(1964)和A.Webb“30分钟从人血清中分离IgG的制备方法”，Vox Sang，23279-290(1972)，本专利技术参考了以上两篇文献。虽然两篇论文都更侧重于从含多种其它污染性蛋白的血清中分离和挑选各种γ球蛋白，但也的确涉及从原血清样品中清除污染性蛋白等物质。它们都采用DEAE-Sephadex柱层析材料和磷酸盐缓冲洗脱液。两人在去除污染蛋白方面都获得了一定程度的成功，然而都没有涉及清除污染性肝炎病毒颗粒以提供安全的注射制剂。 本专利技术的目的之一是提供清除了病毒的纯注射免疫球蛋白。所述基本纯的产品是用本专利技术方法制备的。 本专利技术目的还在于提供纯化免疫球蛋白的生产工艺，较好地满足了时间、空间和蛋白质得率方面的要求。 本专利技术的过滤是通过筛-截留机制实现的，该机制依赖于病毒与滤膜平均孔径之间的相互关系。其效率不受温度、离子强度、病毒效价、压力、pH、表面张力及其它变量等过滤条件的影响。虽然，本专利技术的除垢剂和离子强度条件影响着IgG颗粒通过滤膜的能力，但它们不影响病毒的清除。为本专利技术受让人进行的研究显示，就病毒的灭活和包膜去除而言，所用缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由以下方法制备的无病毒含抗Ｄ抗体免疫球蛋白，所述方法包括：　　　　（ａ）将分离自人血浆的含抗Ｄ抗体免疫球蛋白组分与含非离子赋形剂的高离子强度缓冲液混合；　　　　（ｂ）用公称孔径小于等于３０ｎｍ的超微滤膜对混合物进行超微过滤；　　　　（ｃ）收集超微过滤的滤过液，所述滤过液是基本纯无病毒含抗Ｄ抗体免疫球蛋白。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：RW范霍尔滕，GE小乌伦森，
申请(专利权)人：奥尔托临床诊断股份有限公司，米里坡有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]