一种结合制造技术

本发明专利技术提供了一种结合1H‑NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法。该方法将核磁共振与CRAFT技术结合，为核磁共振混合物分析的新方法。本发明专利技术样品的制备简单，扫描时间短，能够较为全面地反映天麻特征化学成分的信息，对所有组分的灵敏度一致，无偏向性，还可以提供特征化合物的化学位移、偶合常数以及峰面积等大量重要的结构信息；CRAFT对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析快速简便，重现性好，精密度高。该方法是核磁共振技术和CRAFT技术的有机结合，快速有效的实现了对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇定性和定量分析，且不需要对照品和对照试验，消除了由于相位校正，基线校正的积分误差。

A method combining with the effective components of 1H NMR and CRAFT technology, the qualitative and quantitative analysis in Gastrodia elata

The present invention provides a method combining with the effective components of 1H NMR and CRAFT the qualitative and quantitative analysis in Gastrodia elata. In this method, a new method for the analysis of nuclear magnetic resonance (NMR) mixtures is presented by combining NMR and CRAFT. The sample preparation is simple, short scan time, can reflect the characteristics of the chemical constituents of Gastrodia elata information comprehensively, for all components of the sensitivity, no bias, can also provide compounds of chemical shifts, the coupling constants and the peak area and a number of important structural information; CRAFT of gastrodin and qualitative and quantitative analysis of hydroxyl benzene methanol is quick and simple, good repeatability, high precision. This method is a combination of NMR technology and CRAFT technology, rapid and effective implementation of gastrodin and the qualitative and quantitative analysis of hydroxyl benzene methanol, and does not need to control and control test, eliminate the integral error of phase correction, baseline correction.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种结合1H-NMR和CRAFT技术检测天麻中有效成分的方法，属于药品分析检测的

技术介绍
天麻(GastrodiaelataBl.)是兰科天麻属多年生草本植物，主产于我国云南、贵州、四川等地。天麻味甘，性平，微辛，主入肝经，有平肝息风等功能，其根茎入药用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风等症，是名贵中药，贵州产天麻与灵芝、杜仲并称为“贵州三宝”，是一种道地药材。天麻的化学成分主要含酚类及其甙、甾醇类、有机酸类、氨基酸等，还含有具有增强免疫作用的天麻多糖以及多种微量元素。天麻含量较高的主要有效成分是天麻甙(gastrodin)，也称天麻素，其化学组成为对-羟基苯-β-D-吡喃葡萄糖甙(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)。天麻具有镇痛作用，临床有效率高达90％，利用天麻素治疗神经衰弱和神经衰弱综合症病人，有效率均高达85％以上，具有明显的镇静作用，天麻还能治疗高血压，尚有明目和显著增强记忆力的作用等。天麻临床效果明显，天麻注射液、天麻胶囊、天麻酒等一系列天麻中药制剂被逐一开发出来，但其药源紧张，而其药材本身及其中成药未有统一而健全的质量控制标准，以次充好、以假乱真的现象层出不穷，严重影响其用药安全和临床药效。中药指纹图谱是国际上公认的控制天然药物或中草药的最有效的一种手段，可用来鉴别中药的真假，评价中药的品质，具有整体性与模糊性的特点。氢核磁共振(1H-NMR)指纹图谱是中药指纹图谱中一种鉴定和控制植物中药质量的新方法，较最常用的HPLC具有样品预处理简单，色谱分离不会损失样品中的组分；样品的结构和性质不会受到破坏；对样品中所有成分的灵敏度一致的优点，且不需要对照品和对照试验。1H-NMR指纹图谱具有单一性、全面性、易辨性、定量性的特点。所测样品中每个基团上的氢在1H-NMR谱中都有相关的谱峰，且是一一对应的关系，通过化合物结构的研究可归属图谱上的每一个信号，其信号强弱反映样品各个基团上氢的数目比例。通过1H-NMR可获得化合物各个质子的化学位移、偶合常数、峰裂分情况以及峰面积等的大量结构信息。对于中药复杂的化学成分，1H-NMR方法客观而全面地反映了其化学特征和整体化学组成，但是信号的重叠也使图谱变得十分复杂，且受基线校正和相位校正的影响，应用于中药成分的鉴定和含量测定困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种结合1H-NMR和CRAFT技术检测天麻中有效成分的方法。所述方法能快速准确地对天麻中天麻素和对羟基苯甲醇进行定性和定量分析。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案实现：一种结合1H-NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，包括如下步骤：步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备取天麻，按常规方法制成总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，用DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O-TM标准品，以DMSO-d6溶解，制成TMS标准品溶液和O-TM标准品溶液；准确称取间苯三酚标准品，以DMSO-d6溶解，制得间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化采用Varian400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱；步骤三：CRAFT定性分析导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；步骤四：CRAFT定量分析线性关系考察：制备n个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比对天麻总提取物与间苯三酚的质量比(x，Ws/Wr)进行线性回归；精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备n份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量；所述n为自然数。具体地说，所述步骤一中，供试品溶液这样制备：取天麻，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干，粉碎过三号筛，取天麻粉末，加入25倍量50％稀乙醇超声30min，超声条件：150w，40KHz；静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，以0.03倍量的DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品溶液。具体地说，所述步骤一中，对照品溶液这样制备：称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O-TM标准品，以DMSO-d6溶解，制成含量为5.15mg/mLTMS标准品溶液和2.65mg/mLO-TM标准品溶液。具体地说，所述步骤一中，内标溶液这样制备：准确称取间苯三酚标准品，以DMSO-d6溶解，制得含量为10.4mg/mL的间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标。具体地说，所述步骤二为：采用Varian400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱，测定温度为25.0℃，增益为20，延迟时间10s，采样次数为4次，线性加宽因子为1Hz，自旋回波循环时间tau为0.001s，自旋回波循环总时间bigtau依次为0.001s、0.01、0.025s、0.03s、0.05s、0.1s；当bigtau＝0.1s(即100ms)时，大分子信号滤干净了而小分子信号仍在，从而优化了谱图。具体地说，所述步骤三为：导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，下采样因素为32，线展宽为1，CRAFT最大线宽为20，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇。具体地说，所述步骤四中，n＝2-10。更具体地说，所述步骤四中，n＝5。本专利技术通过核磁CPMGT2和CRAFT技术的结合来实现对天麻混合物中主要化合物天麻素和对羟基苯甲醇进行定性和定量分析。其特征是利用了CRAFT(CompleteReductiontoAmplitudeFrequencyTable)技术。CRAFT是核磁共振混合物分析的新方法，应用于天麻有效成分的定性和定量分析，是直接对核磁共振FID信号拟合，全自动化分析一个或者一系列FID，获得复杂混合物谱图中所有信号或感兴趣的特征吸收峰的化学位移，振幅和线宽，消除了由于相位校正，基线校正的积分误差，不需要对照品和对照试验，使用内标法计算本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合1H‑NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备取天麻，按常规方法制成总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，用DMSO‑d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O‑TM标准品，以DMSO‑d6溶解，制成TMS标准品溶液和O‑TM标准品溶液；准确称取间苯三酚标准品，以DMSO‑d6溶解，制得间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化采用Varian 400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱；步骤三：CRAFT定性分析导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；步骤四：CRAFT定量分析线性关系考察：制备n个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比对天麻总提取物与间苯三酚的质量比进行线性回归；精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备n份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量；所述n为自然数。...

【技术特征摘要】
1.一种结合1H-NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：供试品、对照品和内标溶液的制备取天麻，按常规方法制成总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，用DMSO-d6溶解于核磁管中，得供试品溶液；称取天麻素TMS和对羟基苯甲醇O-TM标准品，以DMSO-d6溶解，制成TMS标准品溶液和O-TM标准品溶液；准确称取间苯三酚标准品，以DMSO-d6溶解，制得间苯三酚标准溶液，以作为定量核磁共振的内标；步骤二：1HNMR指纹图谱的测定及优化采用Varian400MHz核磁共振波谱仪，测试天麻供试品溶液的1HNMR指纹图谱，得天麻1HNMR谱图；运用CPMG技术优化图谱；步骤三：CRAFT定性分析导入天麻CPMGT2谱图，进入CRAFT分析软件，对天麻素和对羟基苯甲醇特征峰进行下采样，执行CRAFT计算，导入天麻素和对羟基苯甲醇指纹表，提取频率振幅表，所得频率F、振幅A和CRAFT模型用于定性分析，特征峰频率F所对应的振幅A之比等于其质子数之比，从而鉴定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇；步骤四：CRAFT定量分析线性关系考察：制备n个不同浓度比的天麻提取物和内标物间苯三酚混合待测样品，振荡摇匀后测定其CPMGT2谱图，对每个样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT计算提取其振幅值，求其平均值，分别以天麻素、对羟基苯甲醇与间苯三酚定量峰的振幅比对天麻总提取物与间苯三酚的质量比进行线性回归；精密度考察和定量分析：选取同一批天麻样品，制备n份天麻总提物和内标物间苯三酚的混合样品，测定其CPMGT2谱图，进行精密度的测定，对样品中天麻素、对羟基苯甲醇和间苯三酚的定量峰进行n次CRAFT分析提取其振幅A值，求其平均值，计算天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量；所述n为自然数。2.如权利要求1所述结合1H-NMR和CRAFT技术定性和定量分析天麻中有效成分的方法，其特征在于：所述步骤一中，供试品溶液这样制备：取天麻，蒸50～60min蒸透后切成薄片，烘干，粉碎过三号筛，取天麻粉末，加入25倍量50％稀乙醇超声30min，超声条件：150w，40KHz；静置，用水系微孔滤膜经注射器挤压过滤，取滤液回收溶剂，在50℃烘箱中挥干，得总提物浸膏；准确称取总提物浸膏，以0.03倍量的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建新，黄滔，陈艳，潘卫东，
申请(专利权)人：贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，
类型：发明
国别省市：贵州;52