印鼠客蚤多肽及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种印鼠客蚤多肽及其基因和应用，具体涉及印鼠客蚤多肽FS48在制备治疗Kv1.1相关的疼痛、癌症、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自免疫疾病和慢性感染性疾病药物中应用，其中所述的印鼠客蚤多肽FS48的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术所多肽由以下方法制备得：原核表达印鼠客蚤多肽FS48，然后采用三步柱层析分离纯化后得到。本发明专利技术所述的印鼠客蚤多肽FS48能通过抑制Kv1.1和Kv4.1而具有镇痛、抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用，且无细胞毒性。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种从动物组织得到的蛋白及其用途。
技术介绍
：钾通道是广泛分布于骨骼肌、神经、心脏、血管、腺体等细胞和组织上的一类跨膜蛋白，其在许多细胞兴奋性和非兴奋性细胞的信号传递过程中有重要作用，如，动作电位调节、心脏起搏、信号整合、激素释放、细胞容积调节和细胞增殖等方面(CurrOpinSupportPalliatCare,2015Jun；9(2):147-54)。此外，钾通道在前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌的细胞增殖和生长中的作用也被发现(AnnuRevCellDevBiol,2015；31:231-47)。目前已经有大约80种不同的钾通道亚型被报到，其中Kv1.1在CD4+辅助性T细胞、血管平滑肌细胞、中枢和外周神经元细胞以及肺癌细胞和乳腺癌细胞上表达，其与细胞炎性因子分泌、疼痛信号传导、血管重塑等过程密切相关。因此，Kv1.1是治疗疼痛、癌症、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自免疫疾病和慢性感染性疾病的靶点(PharmacolTher,2016,159:93-101；TrendsNeurosci,2014,37(3):146-58)。例如，抑制Kv1.1能降低A549细胞的增殖使细胞处在细胞周期的静息期；麻醉剂氨基苯甲酸丁酯、布比卡因、丁哌卡因、罗哌卡因和马比佛卡因能抑制Kv1.1具有镇痛作用(Anesthesiology,2008,109(5):895-904)。有毒动物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素是我国传统医药中治疗疑难杂症重要源泉。动物多肽毒素已成为全球研发相关疾病药物的重要资源。例如，中国科学院、军事医学科学院、湖南师范大学等单位的研究人员分别从眼镜蛇、芋螺、蜘蛛的毒素中发现的cobratoxin、SO-3和HWAP-I作为镇痛药物被广泛应用于临床(ExpertOpinBiolTher,2011,11(11):1469-84)；而美国FDA已批准来源于蜥蜴和芋螺毒素的Exenatide和Ziconotide分别用于临床治疗糖尿病和疼痛(MethodsFindExpClinPharmacol,2009，31(7):463-93)。另外，上海大学相关实验室针对东亚钳蝎多肽毒素的系统动物疼痛或镇痛行为模型研究表明我国蝎毒中含有多种致痛/镇痛或癫痫/抗癫痫的膜钠或钾通道活性成份(JNeurooncol,2005,73(1):53-56；JClinOncol,2006,24(22):3644-3650)。因此，动物毒素将是研发新药的有效途径。我国对蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素的药用研究有悠久的历史，但对跳蚤等吸血节肢动物体内药理活性组分研究不多。吸血节肢动物通常需要在生命周期内的一定时期吸血以完成生命循环。在长期的吸血进化过程中，吸血节肢动物在其唾液内形成了众多的药理活性物质以克服宿主的防御。如，牛虻的唾液腺中含有许多血小板聚集抑制因子、抗血浆凝集因子、血管舒张剂和免疫调节肽等。因此牛虻成为活血化瘀中药材(MolCellProteomics,2008,7(3):582-90)。印鼠客蚤(Xenopsyllacheopis)是我国常见的吸血昆虫，分布于除新疆、西藏和宁夏外的广大地区。它们只有从小家鼠、褐家鼠、黄胸鼠和人身上吸血后才能产卵完成生命周期。专利技术人将本专利技术的印鼠客蚤多肽FS48在pubmed数据库进行搜寻比较，未发现有任何关于该蛋白功能的报道。
技术实现思路
：为了解决上述问题，本专利技术一个方面提供了一种印鼠客蚤多肽FS48，其序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术另一个方面提供了编码如前1所述的多肽的核苷酸。本专利技术再一个方面提供了一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核苷酸，以及可药用的辅料。其中，所述药物组合物其制剂为注射剂。本专利技术再一个方面提供了一种前述的印鼠客蚤多肽FS48的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)提取印鼠客蚤唾液腺总mRNA，并采用SEQIDNO：2所示的上游引物和SEQIDNO：3所示的下游引物扩增编码SEQIDNO：4所示的印鼠客蚤抗心律失常的基因，然后先将该基因克隆到pET-17b表达载体中，再转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中重组表达，并收集目的细胞超声上清；(2)将所收集的上清透析后依次上HiprepSP阳离子交换色谱柱、SephadexSR-100凝胶过滤柱、HiprepSP阳离子交换色谱柱和SephadexTMG7510/300GL凝胶过滤柱层析，得到如SEQIDNO：1所示的印鼠客蚤唾液腺基因重组表达蛋白，即印鼠客蚤多肽FS48。本专利技术一个方面提供了前述的多肽或者前述的药物组合物在制备抗肿瘤的药物中的用途。本专利技术一个方面提供了前述的多肽或者前述的药物组合物在制备镇痛和/或抗炎的药物中的用途。本专利技术一个方面提供了前述的多肽或者前述的药物组合物在制备治疗神经退行性疾病或心脑血管疾病或自免疫疾病或慢性感染疾病的药物中的用途。本专利技术一个方面提供了前述的多肽或者前述的药物组合物在制备靶向Kv1.1的药物中的用途。多肽多肽多肽多肽本专利技术的印鼠客蚤唾液腺多肽FS48，对大鼠背根神经节上的钾离子通道有明显的抑制作用，并且该毒素能够选择性的作用钾离子通道亚型Kv1.1、Kv1.2和Kv4.1。印鼠客蚤唾液腺多肽FS48在小鼠的疼痛模型及炎症模型上表明出很好的治疗效果，能显著影响小鼠脾细胞增殖和细胞因子分泌，且能抑制非小细胞肺癌细胞NCI-H460的迁移。因此印鼠客蚤唾液腺多肽FS48能够在治疗K1.1相关的疼痛、癌症、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自免疫疾病和慢性感染性疾病的药物中得到应用。附图说明：图1为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48大肠杆菌表达结果电泳图。从左到有泳道分别是蛋白质标准，37℃1.0mMIPTG诱导样品，37℃0.4mMIPTG诱导样品，30℃0.4mMIPTG诱导样品，箭头所示为目的带。图2为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48的分离纯化图，图中，箭头所示为目的峰，A、B、C和D分别是利用HiprepSP阳离子交换、SephadexSR-100凝胶过滤、HiprepSP阳离子交换和SephadexTMG7510/300GL凝胶过滤色谱柱层析后得到的图，其中图2D中电泳图是SephadexTMG7510/300GL凝胶过滤层析后得到的纯蛋白电泳结果，图中条带为目的蛋白，其被切胶用于N末端测序。图3为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48膜片钳分析结果图。A，样品对DRG上钾电流的影响；B，为样品对表达Kv4.1哺乳动物细胞钾电流的影响；C，为样品对表达Kv2.1哺乳动物细胞钾电流的影响；D，为样品对表达Kv1.1哺乳动物细胞钾电流的影响；E，为样品对Kv1.1通道抑制的浓度依赖曲线；F，为样品对Kv1.1通道稳定活化的影响。图4为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48的镇痛效果。A为鼠尾热痛实验结果；B为福尔马林致痛实验结果；C为醋酸扭体实验结果。图5为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48的抗炎效果。A为FS48对小鼠脚爪肿胀体积的影响，B为FS48对小鼠脚爪髓过氧化物酶活性的影响。图6为本专利技术印鼠客蚤多肽FS48抗肿瘤划痕实验结果。A为FS48对肿瘤细胞迁移的影响，B为统计学分析。图7为本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种印鼠客蚤多肽FS48，其序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种印鼠客蚤多肽FS48，其序列如SEQIDNo.1所示。2.编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸。3.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核苷酸，以及可药用的辅料。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其制剂为注射剂。5.一种权利要求1所述的印鼠客蚤多肽FS48的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)提取印鼠客蚤唾液腺总mRNA，并采用SEQIDNO：2所示的上游引物和SEQIDNO：3所示的下游引物扩增编码SEQIDNO：4所示的印鼠客蚤抗心律失常的基因，然后先将该基因克隆到pET-17b表达载体中，再转化到BL21(DE3)pLysS大肠杆菌中重组表达，并收集目的细胞超声上清；(2)将所收集的上清透析后依次上...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学清，张贝，邓振晖，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44