一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2‑20℃放置0.5‑12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。该方法中聚阳离子化合物可以提高外源DNA对核酸酶、酸和自由基等条件的耐受性，使其可作为溯源和防伪的内标物在液态产品或商品中长期稳定存在。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于防伪鉴定
，尤其涉及一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法及其应用。
技术介绍
近年来，由于商品掺假造假的现象层出不穷，消费者对于商品的防伪和溯源尤为重视。尤其是对于食品类产品，由于其关乎国民的身体健康，更是消费者和国家监管部门的关注重点。目前商品的防伪和溯源措施主要是外包装防伪，即将各种特殊标识附于外包装上，或是利用特殊的外包装构造以便消费者和检验机构的识别。然而，由于外包装防伪的易破坏性和易仿造性，给不法分子留下了可乘之机。随着食品产业溯源体系的建立和完善，通过在食品中加入外源核酸作为溯源标记物的新型技术逐渐被开发应用。例如中国专利申请CN101665825A公开了一种利用核酸检测技术鉴别白酒真伪的方法，其将动物、植物、微生物或人工合成的基因组DNA或基因片段加入到白酒内作为其内标物，再运用PCR技术检测内标物的有无来判断商品的真伪。然而，由于绝大多数的液态产品尤其是液态食品中存在诸多核酸破坏因子(如核酸酶、自由基和酸等)，DNA在液态产品中经长时间存放后会发生脱嘌呤、氧化或断裂等损伤，造成序列信息的丢失，最终导致检测的假阴性，这将大大限制其作为标记物在产品防伪和溯源中的应用。因此，目前亟需一种提高DNA稳定性的方法来实现其在液态产品中的长期稳定存在。目前在实际应用中已有一些提高DNA稳定性的方法。比如，使用Tris-EDTA缓冲液溶解核酸来维持体系的弱碱性环境；在反应体系中加入还原剂(如DTT)来防止核酸被氧化；或是将核酸进行结构改造或修饰来提高其对核酸酶的耐受性等。但由于这些方法需要改变产品的理化性质或加入有毒有害的化学试剂，或需要复杂、造价高的改造或修饰步骤，很难在实际产业中得到应用。显然，如果能使用简单方便、成本低廉、无毒无害，且不影响DNA结构和性质的方法提高外源DNA在产品中的稳定性，将大大扩大DNA标记物在商品防伪和溯源中的应用范围和前景。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术旨在提供一种简单方便、成本低廉、无毒无害，且不影响DNA结构和性质的方法，用以保护液态产品中的外源DNA。一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2-20℃放置0.5-12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。溶液中，核酸的磷酸基团上的负电荷可与聚阳离子化合物携带的正电荷相互作用，大大减缓DNA在酸性条件下的脱嘌呤反应，从而提高了其对酸性环境的耐受性。此外，由于聚阳离子化合物围绕在DNA的周围，阻碍了核酸酶与DNA的结合，同时也阻碍了自由基对DNA的攻击，从而也提高了DNA对核酸酶和自由基的耐受性。本专利技术中将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液混合后放置的温度控制在2-20℃之间，首先确保溶液处在液体状态以进行DNA与聚阳离子化合物之间的相互作用，但是温度不宜过高，经验证，当温度超过20℃时，聚阳离子化合物对DNA的保护效果不佳，且易导致微生物繁殖。本专利技术中将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液混合后放置的时间控制在0.5-12小时，经验证超过0.5小时时DNA即可与聚阳离子化合物形成复合物，且随着时间延长更有利于DNA与聚阳离子化合物充分作用，但时间过长则易导致微生物繁殖。进一步地，聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液混匀后放置的温度为2-8℃，时间为6-12小时，在可能的范围内选择低温、长时间，能保证DNA与聚阳离子化合物充分作用，并防止微生物繁殖。经证实(参见实施例1)，氨基磷酸比在1-100:1时，聚阳离子化合物都能够发挥对DNA的保护作用，随着氨基磷酸比的增大，保护作用逐渐增强。但当氨基磷酸比大于10:1时，保护作用基本不变，因此氨基磷酸比的最优选择是10:1。既能达到理想的保护效果，又可有效控制成本。进一步地，所述的DNA包括但不限于基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA、PCR产物、DNA酶切片段或多聚寡核苷酸中的一种或多种。优选质粒DNA、PCR产物，更易制得，成本相对较低，适于工业化应用。所述的基因组DNA包括所有生物的基因组DNA，优选鲑鱼精DNA、鲱鱼精DNA或λDNA中的一种或多种，因为这些基因组DNA量大易得，且已商品化，易购买得到。所述的质粒DNA包括但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBR322、pTZ19R或pET28中的一种或多种。进一步地，所述的聚阳离子化合物为一类可在溶液中聚集正电荷的化合物，包括但不限于壳寡糖、壳聚糖、精胺、腐胺、尸胺、亚精胺、多肽或碱性蛋白质中的一种或多种。更进一步地，所述碱性蛋白质包括精蛋白和组蛋白等。更进一步地，所述壳聚糖的分子量在20-250kDa，一般市售壳聚糖的分子量均在该范围内，因此该类壳聚糖更易得。进一步地，所述DNA复合物溶液的pH＝6-8，避免添加到产品中后影响产品本身的理化性质。本专利技术的另一个目的是提供一种上述DNA保护方法的具体应用，即应用到液态产品的防伪和溯源中。一种液态产品的防伪和溯源方法，具体步骤为：(1)将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2-20℃放置0.5-12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，所述的氨基磷酸比为聚阳离子化合物所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值；(2)将步骤(1)中得到的DNA复合物溶液添加到液态产品中，添加量以DNA的量计，使液态产品中DNA的含量为1ng/mL-50μg/mL；由于本专利技术方法对DNA的保护效果优良，DNA在液态产品中可稳定存在，因此加入量只要达到DNA的检出限即可；实际添加的DNA复合物的体积远远小于液态产品的体积，可有效保证产品的品质和外观等；(3)检测液态产品中是否含有所添加的DNA。进一步地，步骤(3)中检测DNA的方法包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、常规PCR、实时荧光定量PCR或恒温核酸扩增等方法中的一种或多种。相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术使用无毒无害的聚阳离子化合物(如壳寡糖和壳聚糖)对外源DNA进行保护，提高外源DNA对核酸酶、酸和自由基等条件的耐受性，使DNA内标物能够稳定地存在于成分复杂的液态产品中，以应用于液态产品尤其是液态食品的溯源和防伪中。(2)采用将DNA与聚阳离子化合物混合放置的方式简单方便，技术水平要求低，方便批量生产。(3)聚阳离子化合物的种类较多，原料易得，成本较低。(4)由于核酸具有聚阴离子的基本特性，在溶液中，核酸的磷酸基团上的负电荷可与聚阳离子化合物携带的正电荷相互作用，形成相对稳定的复合物。由于聚阳离子化合物是通过正负电荷相互作用与DNA结合，并非共价结合，对DNA的结构和性质都几乎无影响，因此不影响对DNA进行电泳、PCR或其他方式的检测。附图说明图1：本专利技术实施例1-7实施方法的路线示意图；图2：本专利技术实施例1的核酸琼脂糖凝胶电泳结果图；其中，数字比值代表聚阳离子化合物与DNA的氨基磷酸比；图3：本专利技术实施例1的核酸琼脂糖凝胶电泳结果图；图4：本专利技术实施例2的核酸变性聚丙烯酰胺凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2‑20℃放置0.5‑12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子化合物所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。

【技术特征摘要】
1.一种液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，具体如下：将聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液按照氨基磷酸比≥10:1的比例混合，混匀后2-20℃放置0.5-12小时，得到稳定的DNA复合物溶液，可直接添加至液态产品中；所述的氨基磷酸比为聚阳离子化合物所携带的氨基摩尔数与DNA携带的磷酸基团摩尔数的比值。2.根据权利要求1所述的液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，聚阳离子化合物溶液与目的DNA溶液混匀后放置的温度为2-8℃，时间为6-12小时。3.根据权利要求1所述的液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，所述的聚阳离子化合物为一类可在溶液中聚集正电荷的化合物，包括壳寡糖、壳聚糖、精胺、腐胺、尸胺、亚精胺、多肽或碱性蛋白质中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，所述的壳聚糖的分子量在20-250kDa。5.根据权利要求1或3所述的液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征在于，所述的DNA包括基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、质粒DNA、PCR产物、DNA酶切片段或多聚寡核苷酸中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的液态产品中外源DNA内标物的保护方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：安然，梁兴国，王鹏飞，
申请(专利权)人：青岛千卓分子生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37