一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织化学方法技术

本发明专利技术公开了一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织方法，包括如下步骤：a)将橡胶树树皮修切成长0.5cm×宽0.5cm的切片组织块，置于盛有固定液的离心管中；b)打开离心管盖子，放入连接真空泵的玻璃干燥器中，抽气1‑2min；c)换新鲜的固定液，在室温条件下固定4‑6h后，用缓冲液浸洗3次，每次30min；d)将步骤c)中的材料从固定液过渡到不同浓度梯度的保护剂中；e)将步骤d)中最高浓度保护剂中的材料，用OCT包埋剂中包埋，置于‑20℃冷冻台，冷凝20分钟；f)取出步骤e)中的材料，按常规冰冻切片方法进行切片；g)用室温的普通载玻片粘取切片；h)用封片剂封片，荧光显微镜观察。本发明专利技术方法操作简单、省工省地、重复性和通用性好并可批量筛选。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业组织化学
，涉及一种植物组织的显示方法，具体涉及一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织化学方法。
技术介绍
橡胶树的乳管有两类：由初生分生生组织分化形成的初生乳管和由维管形成层分化形成的次生乳管。初生乳管分布在橡胶树叶、花、果实、种子和根、茎的初生结构中。次生乳管分布在次生韧皮部中。与天然橡胶生产直接相关的乳管是分布在树干树皮中的次生乳管。有证据表明，树干树皮中的次生乳管数量与天然橡胶产量高度正相关(HaoBZ,WuJL.BiologyoflaticifersinHeveaandlatexproduction.ChineseJTropCrops,2004,25(4):1-7)。根据文献报道，次生乳管数量多少取决于维管形成层分化乳管的能力。然而，由于次生乳管发育的阶段性和器官特异性，在橡胶树新生萌条中没有次生乳管，而且次生乳管数目的差异在1-3龄幼树上还不能表现出来(周钟毓，国外巴西橡胶树产量早期预测方法研究概况，《热带农业科学》，1993年，第2期，第77-83页)。目前，显示橡胶树乳管的方法基于史自强和胡正海报道的方法(ShiZQ,HuZH,Ahistologicalmethodforrubber-bearingtissuesofplants,《ActBotSin》,1965,13,179-182)，其关键环节是用碘和溴的冰醋酸溶液处理含胶组织，经石蜡切片，在光学显微镜下观察。该方法应用于显示橡胶树树皮中的乳管时，有几个环节进行了改进(HaoBZ,WuJL.BiologyoflaticifersinHeveaandlatexproduction.《ChineseJTropCrops》,2004,25(4):1-7)。具体包括：1)固定液用80％的乙醇代替FAA固定液，目的是溶解单宁类物质，避免把含单宁的薄壁细胞误认为乳管细胞；2)含胶组织置于碘和溴的冰醋酸溶液中，在60-65℃条件下处理36-48小时，可以加深橡胶颜色，容易分辨乳管细胞；3)在组织透明环节，使用毒性较小的正丁醇或叔丁醇代替毒性较大的二甲苯。在此基础上，专利技术人进一步开发了一种苗期预测橡胶树乳管分化能力的方法(中国专利技术专利ZL200810003352.7)。这种方法通过机械伤害一年生萌条的第1伸长单位着生鳞片叶的茎得以实现，从而能够很好地在苗期预测亚马逊野生种质和魏克汉种质的次生乳管分化能力。但是，这种显示乳管的方法存在两个主要缺点：1)步骤繁多，费时，容易弄错标签，切片质量不容易重复。该方法的操作流程有40多个步骤，从材料固定到切片观察需要7-10天，而且在材料比较多的时候，容易弄错标签。此外，由于步骤多，如果操作不熟练，切片质量不容易重复；2)使用的挥发性有毒的试剂较多。除酒精外，还需要腐蚀性的溴和冰醋酸、具有一定毒性的正丁醇和二甲苯。此外，多个步骤在高温下操作，存在安全隐患。针对上述多种缺陷，迫切需要建立一种快捷而安全的显示树皮乳管的方法。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织化学方法。为实现上述目的，本专利技术提供了如下快速显示橡胶树树皮乳管的组织方法，包括如下步骤：a)将橡胶树树皮修切成长0.5cm×宽0.5cm的切片组织块，置于盛有固定液的离心管中；b)打开离心管盖子，放入连接真空泵的玻璃干燥器中，抽气1-2min；c)换新鲜的固定液，在室温条件下固定4-6h后，用缓冲液浸洗3次，每次30min；d)将步骤c)中的材料从固定液过渡到不同浓度梯度的保护剂中；e)将步骤d)中最高浓度保护剂中的材料，用OCT包埋剂中包埋，置于-20℃冷冻台，冷凝20min；f)取出步骤e)中的材料，按常规冰冻切片方法进行切片；g)用室温的普通载玻片粘取切片；h)用封片剂封片，荧光显微镜观察。步骤a)中，所述橡胶树树皮指用单面刀片从橡胶树萌条上纵向切割的带有部分木质部的树皮；所述切片组织块的两端平切。橡胶树幼树树皮的取皮方法如图1所示。步骤b)中，所述固定液选自包含多聚甲醛和戊二醛的溶液。在一个具体实施方式中，所述固定液是4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊二醛的0.01M的pH7.2磷酸缓冲液。所述离心管为普通带盖子的塑料或玻璃离心管；离心管规格是1.5-10mL的试管。有利地，所述固定液的体积为离心管规格的二分之一至三分之二。在一个具体实施方式中，离心管规格是5mL的离心管；所述固定液的体积为3mL。步骤c)中，所述缓冲液具体为0.01M的pH7.2磷酸缓冲液。步骤d)中，所述保护剂为蔗糖水溶液。进一步地，所述不同浓度梯度的保护剂选自2wt％蔗糖水溶液、6wt％蔗糖水溶液、10wt％蔗糖水溶液、12wt％蔗糖水溶液、14wt％蔗糖水溶液、16wt％蔗糖水溶液和20wt％蔗糖水溶液的任意三种或三种以上。优选地，所述不同浓度梯度的保护剂选自2wt％蔗糖水溶液、6wt％蔗糖水溶液、10wt％蔗糖水溶液、12wt％蔗糖水溶液、14wt％蔗糖水溶液和16wt％蔗糖水溶液的任意三种或三种以上。例如，所述不同浓度梯度包含的浓度数量可以是3个,例如2wt％、6wt％和12wt％；浓度数量也可以是4个，6wt％、10wt％、12wt％和14wt％。步骤e)中，所述高浓度保护剂为12wt％、14wt％、16wt％和20wt％的蔗糖水溶液；所述冷冻台温度为-18至-22℃；所述冷凝时间为15-30min。步骤h)中，所述封片剂为甘油为5wt％甘油水溶液。在本专利技术中，所述橡胶树为1-3年生的幼树。在本专利技术中，在荧光显微镜的白光下观察，乳管中的物质棕褐色；在荧光显微镜的488nm蓝光激发下，乳管中的物质呈绿色。与现有技术相比，本专利技术具有下列有益的技术效果：第一，操作简单，节省时间。最多两天完成实验流程，时间主要花在固定和保护这两个环节。由于环节少，操作简单，切片的质量重复性好，而且不容易弄错标签。第二，在整个方法中不使用挥发性有毒的试剂，同时所有步骤在室温和低温下操作，不存在安全隐患。第三，具有取材方便、省工省地、重复性和通用性好以及批量筛选的优点。附图说明图1是橡胶树幼树树皮取皮示意图(其中，外侧区域示树皮，内部区域示木质部。用单面刀片取幼树树皮材料，包括树皮、形成层和部分木质部；虚线处示修切树皮材料的部位；右图示修切树皮的立体示意图)；图2是一年生幼树树皮的初生乳管的树皮横切面图(其中，A为10倍物镜明场条件下树皮横切面图，B为10倍物镜荧光条件下树皮横切面图。三角形示表皮，五角星示厚壁组织，箭头示初生乳管；V：导管，Ca：维管形成层，St：筛管，标尺：100μm，切片厚度：14μm，物镜倍数为10倍)；图3是一年生幼树树皮在机械伤害处理后的初生乳管和次生乳管的5倍物镜明场条件下树皮横切面图(其中，五角星示厚壁组织；由上至下，第一排箭头示木栓层，第二排箭头示初生乳管，第三排箭头示次生乳管；V：导管，Ca：维管形成层，St：筛管，标尺：100μm，切片厚度：12μm，物镜倍数为5倍)；图4是一年生幼树树皮在茉莉酸处理后的初生乳管和次生乳管的树皮横切面图(其中，A为10倍物镜明场条件下树皮横切面图，B为10倍物镜荧光条件下树皮横切面图。五角星示厚壁组织；由上至下，第一排箭头示木栓层，第二排箭头示初生乳管，第三排箭头示次生乳管，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织方法，包括如下步骤：a)将橡胶树树皮修切成长0.5cm×宽0.5cm的切片组织块，置于盛有固定液的离心管中；b)打开离心管盖子，放入连接真空泵的玻璃干燥器中，抽气1‑2min；c)换新鲜的固定液，在室温条件下固定4‑6h后，用缓冲液浸洗3次，每次30min；d)将步骤c)中的材料从固定液过渡到不同浓度梯度的保护剂中；e)将步骤d)中最高浓度保护剂中的材料，用OCT包埋剂中包埋，置于‑20℃冷冻台，冷凝20分钟；f)取出步骤e)中的材料，按常规冰冻切片方法进行切片；g)用室温的普通载玻片粘取切片；h)用封片剂封片，荧光显微镜观察。

【技术特征摘要】
1.一种快速显示橡胶树树皮乳管的组织方法，包括如下步骤：a)将橡胶树树皮修切成长0.5cm×宽0.5cm的切片组织块，置于盛有固定液的离心管中；b)打开离心管盖子，放入连接真空泵的玻璃干燥器中，抽气1-2min；c)换新鲜的固定液，在室温条件下固定4-6h后，用缓冲液浸洗3次，每次30min；d)将步骤c)中的材料从固定液过渡到不同浓度梯度的保护剂中；e)将步骤d)中最高浓度保护剂中的材料，用OCT包埋剂中包埋，置于-20℃冷冻台，冷凝20分钟；f)取出步骤e)中的材料，按常规冰冻切片方法进行切片；g)用室温的普通载玻片粘取切片；h)用封片剂封片，荧光显微镜观察。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤a)中，所述橡胶树树皮指用单面刀片从橡胶树萌条上纵向切割的带有部分木质部的树皮；所述切片组织块的两端平切。3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤b)中，所述固定液是4wt％多聚甲醛和2.5wt％戊...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世鑫，田维敏，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院橡胶研究所，
类型：发明
国别省市：海南;46