用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法技术

本发明专利技术涉及荧光寿命成像领域，为拓展在相同激光频率条件下的荧光寿命估算范围，进而提高寿命估算准确度。本发明专利技术对RLD预估算方法进行了改进，避免了迭代运算。本发明专利技术采用的技术方案是，用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，包括如下步骤：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，记录到的总光子数为NC，量化得到的光子到达时间总和为NT；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。本发明专利技术主要应用于荧光寿命成像产品设计制造场合。

Correction method of centroid algorithm for calculating fluorescence lifetime

The invention relates to the field of fluorescence lifetime imaging, in order to extend the estimation range of fluorescence lifetime under the condition of the same laser frequency and improve the accuracy of the life estimation. The invention improves the RLD pre estimation method, and avoids the iterative operation. The technical scheme of the invention is a method for correcting the centroid algorithm to calculate the fluorescence lifetime, which comprises the following steps: to restore the decay time tau, laser frequency domain time correlated single photon counting system using TCSPC for F, the total recorded photon number NC, the amount of the total photon arrival time NT; definition and threshold determination, below the threshold by using a nonlinear iterative compensation life deviation, otherwise by RLD method to estimate the fluorescence lifetime, then the final corrected fluorescence lifetime by nonlinear compensation. The invention is mainly applied to the design and manufacture of fluorescence lifetime imaging products.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及荧光寿命成像领域，尤其是实时荧光衰减寿命的估算算法。适用于高速荧光寿命分析。具体讲，涉及硬件可执行的质心算法(Center of Mass Method,CMM)，尤其涉及用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法。
技术介绍
荧光寿命不受激发光强度变化、荧光团的浓度和环境吸收等因素的影响，具有非常高的灵敏度和分子特异性。荧光寿命成像通过荧光示踪剂分子在不同环境中激发荧光衰减时间的不同，对微环境进行定量测量。荧光成像分析技术广泛应用于生命科学、医学等领域，如临床医疗诊断、血液病理学研究、离子浓度与氧压测定等。在衰减寿命的估算方法中，质心算法相比迭代算法具有计算量小的优势，且能够通过硬件或片上资源执行运算。此外，质心算法在所有的寿命还原算法中具有最高的光子利用效率。适合应用于具有较高光子收集效率的时间相关单光子计数(Time-correlated single-photon counting,TCSPC)系统中，与能够兼容CMOS工艺的单光子雪崩二极管(Single Photon Avalanche Diode,SPAD)也有较好的处理兼容性。对于单指数响应的荧光寿命衰减曲线：其中f(t)为激发荧光的强度，A为激发荧光强度的幅度，t为以荧光分子受激时刻为起点的时间轴，τ为待还原的荧光分子衰减寿命。荧光光子激发后，通过时间数字转换器(Time-to-digital Converter,TDC)量化光子到达时间，在探测时间内，通过绘制不同光子到达时间的光子计数值分布图，进行寿命还原，如图1所示。采用质心算法直接得到的质心寿命为：其中T为激光周期。通过公式(2)可以看出，CMM算法直接估算出的寿命τCM与样本待还原寿命τ有偏差，偏差量为公式(2)最后一项。通常需要对直接得到的粗糙的估算寿命进行校正，即补偿公式(2)最后一项所带来的偏差。传统的非线性校正方法是直接估算出的寿命τCM直接带入到公式(2)中最后一项的τ中，进行近似补偿。通过传统非线性补偿进行校正后得到的寿命为：传统的CMM校正方法是把通过近似寿命的一次迭代进行非线性补偿。当所探测的荧光寿命较短时，其精确度较好；但当所探测的荧光寿命与激光周期相近时，由于非线性补偿的偏离变得严重，对质心点的补偿能力下降，寿命还原的精确度快速降低。因此传统非线性补偿方法在估算长时间衰减的荧光分子时，需要配合更低频率的激光。同时这也降低了成像系统的帧频，增加了系统功耗。另一种还原样本荧光寿命的算法是快速寿命估算(Rapid Lifetime Determination,RLD)，其原理方法如图2所示，通过荧光衰减过程中两点荧光计数强度的比值，估算荧光寿命，寿命还原公式为：其中t2和t1为荧光衰减过程中两个测量时间点，而N1和N2分别是t1和t2时间点处的计数码值。RLD算法的优势是算法简单，速度快，但缺点十分明显，精度不高，光子利用率十分低，选通门延时时间难以控制。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术结合传统RLD算法与CMM算法，旨在通过RLD的预估算和基于CMM迭代运算的细校正方法，拓展在相同激光频率条件下的荧光寿命估算范围，进而提高寿命估算准确度。本专利技术对RLD预估算方法进行了改进，避免了迭代运算。本专利技术采用的技术方案是，用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，包括如下步骤：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，周期为T，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，质心算法CMM算法每个数据提取的时间周期为TT，TT时间长度为p个激光周期T，把每个探测时间窗口分为m部分，即求解窗口数目为m，每个部分的光子计数数值分别为N1，N2……Nm，需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值KN和理论计算所得到的光子计数比值K0，记录到的总光子数为NC，量化得到的光子到达时间总和为NT；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。定义阈值并进行判定具体步骤是，CMM寿命还原的误差不超过ε，非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，如表1所示，通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围；另一方面，T/τ与光子计数比值K0的关系也是确定的，通过查表进一步可以确定ε与K0的关系：表1其中NT1，NTm是理论计算的光子计数值，K0是理论得出的计数比值关系，而KN是实测得到的光子计数比值，若K0<KN，则采用质心算法CMM，若K0>KN，则选择两级校正方法。两级校正方法即首先通过RLD方法估算出荧光寿命，再把RLD估算出的寿命值通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命，具体步骤是，已得到光子计数比值KN，则通过有理函数近似可以得到：其中N1，Nm分别是实测的光子计数值，τRLD是采用基于有理函数拟合近似表达式得到的寿命；将τRLD带入到误差校正式中(2)得到：其中t代表时间，T为激光周期，τ为待还原的荧光分子衰减寿命，τCMMT为两级校正后的最终估算寿命。本专利技术的特点及有益效果是：传统的非线性补偿方法的误差主要来源于迭代过程中使用的质心直接估算值，该直接估算值在长衰减寿命估算时是不准确的。本专利技术采用RLD方法得到精确度较高的估算值，再进行迭代计算，提高了寿命还原的精确度，拓展了荧光寿命的还原范围，解除了估算长寿命时对激光频率的限制。附图说明：图1：基于TCSPC的荧光寿命成像原理；图2：RLD算法荧光寿命还原原理；图3：本专利技术对质心算法估算寿命的补偿方法；图4：采用本专利技术校正方法得到的荧光寿命还原误差曲线；图5：本专利技术校正方法的寿命还原误差与求解窗口数目的关系曲线。具体实施方式本专利技术采用的技术方案是，基于RLD预估算的两步校正方法，校正方法在计算机或FPGA中进行处理执行，包括如下步骤：待还原的衰减寿命为τ，时域TCSPC系统采用的激光频率为F(周期为T)，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，CMM算法每个数据提取的时间周期为TT(TT时间长度为p个激光周期T)，软件处理系统把每个探测时间窗口分为m部分(即求解窗口数目为m)，每个部分的光子计数数值分别为N1，N2，Nm，两步校正过程中需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值KN和理论计算所得到的光子计数比值K0，记录到的总光子数为NC，量化得到的光子到达时间总和为NT。具体校正流程为：具体校正流程如图3所示：第一阶段，定义阈值并进行判定。与激光周期相比，较短的衰减寿命采用传统非线性校正方法的准确度较高；较长的衰减寿命则有误差较高的问题。因此需要经过判断过程选择不同校正模式。对于仍然能够满足精度要求的寿命范围，传统非线性校正方法简洁高效；但对于不能够满足精度要求的寿命范围，则要采用本专利技术所提供的校正方法。根据具体应用环境条件的要求，CMM寿命还原的误差不超过ε。非线性补偿还原的寿命误差与T/τ比值的关系是固定的，如表1所示。通过查表可以得到误差不超过ε对应的T/τ的范围。另一方面，T/τ与光子计数比值K0的关系也是确定的，通过查表进一步可以确定ε与K0的关系。表1其中NT1，N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，其特征是，步骤如下：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，周期为T，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，质心算法CMM算法每个数据提取的时间周期为TT，TT时间长度为p个激光周期T，把每个探测时间窗口分为m部分，即求解窗口数目为m，每个部分的光子计数数值分别为N1，N2……Nm，需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值KN和理论计算所得到的光子计数比值K0，记录到的总光子数为NC，量化得到的光子到达时间总和为NT；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。

【技术特征摘要】
1.一种用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，其特征是，步骤如下：待还原的衰减寿命为τ，时域时间相关单光子计数TCSPC系统采用的激光频率为F，周期为T，每个激光周期看作一个探测窗口，且每个激光周期内至多能够记录到一个光子，质心算法CMM算法每个数据提取的时间周期为TT，TT时间长度为p个激光周期T，把每个探测时间窗口分为m部分，即求解窗口数目为m，每个部分的光子计数数值分别为N1，N2……Nm，需要的判定对比的参数为实测得到的光子计数比值KN和理论计算所得到的光子计数比值K0，记录到的总光子数为NC，量化得到的光子到达时间总和为NT；定义阈值并进行判定，低于阈值时采用采用非线性一次迭代补偿寿命偏差，否则通过RLD方法估算出荧光寿命，再通过非线性补偿进行校正后得到最终荧光寿命。2.如权利要求1所述的用于计算荧光寿命的质心算法的校正方法，其特征是，定义阈值并进行判定具体步骤是，CMM寿命还原的误差不超过ε，非线性补偿还原的寿命误差与T...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐江涛，乔俊，高静，史再峰，高志远，聂凯明，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12