本发明专利技术为白蜡虫抗冻蛋白基因ep‑afp及其编码的氨基酸序列，涉及分子生物学以及基因工程领域。本发明专利技术以我国东北地区耐极端低温的白蜡虫为材料，通过PCR扩增得到目的片段，连接到pGEM‑T载体上构建重组质粒，获得ep‑afp基因的阳性重组克隆；利用同源重组构建原核表达载体pET‑22b/afp，重组质粒转入BL21表达菌株中进行原核表达，利用差示扫描量热法分析纯化蛋白的热滞活性为0.91℃。根据烟草密码子修改后的白蜡虫抗冻蛋白基因序列作为提高植物抗寒性转化的重要候选基因。本发明专利技术的白蜡虫抗冻蛋白ep‑afp是具备抗冻作用的新的蛋白，具有很大的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学以及基因工程领域。特别是一种存在于白蜡虫中的抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的核苷酸序列。
技术介绍
白蜡虫在我国广大地区均有分布，2006年在吉林长春也首次发现了白蜡虫。至此，在最冷月平均气温-10.2℃，极端最低气温-31.0℃的严寒地带仍有白蜡虫自然种群存在，说明该虫对低温具有极不寻常的适应能力。昆虫耐寒性是受多种机制控制，其中抗冻蛋白antifreeze protein AFP的诱导表达在昆虫抗寒中扮演重要作用。AFP通过其热滞活性可以使冰点下降3-6℃，AFP的产生不但可以使昆虫机体长时间地维持亚稳态的过冷却状态，也能够组织体表的冰进一步进入体液中，此外，AFP不仅能提高血淋巴的过冷却能力，对于维持机体内的离子梯度也有重要的功能。抗冻蛋白的主要功能就是热滞活性，昆虫抗冻蛋白的热滞活性相比于鱼类或植物其抑制冰晶生长的活性更高。一些昆虫抗冻蛋白己被克隆和表达，昆虫抗冻蛋白的活性比鱼类抗冻蛋白活性高3-4倍。目前抗冻蛋白的研究主要集中在为数不多的几个物种，这些物种的抗冻能力远不及白蜡虫。本研究以东北地区耐极端低温的白蜡虫为研究材料，结合高通量测序技术，发掘具有较高热滞活性的抗冻蛋白，作为提高植物抗寒性转化的首选基因。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有抗冻性能的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp及其编码的氨基酸序列。本专利技术以我国东北地区耐极端低温的白蜡虫为材料，通过PCR扩增得到目的片段，连接到pGEM-T载体上构建重组质粒，获得ep-afp基因的阳性重组克隆；利用同源重组构建原核表达载体pET-22b/afp，重组质粒转入BL21表达菌株中进行原核表达，利用差示扫描量热法分析纯化蛋白的热滞活性为0.91℃。本专利技术的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp核苷酸全长序列或其片段采用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得，白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:1具体如下：ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGTTAG本专利技术的用白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp编码的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，SEQ ID NO:2具体如下：用于植物转基因时，根据烟草密码子偏好性修改的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:3具体如下：ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGT本专利技术中所用的方法均为同领域技术人员公知的方法。本专利技术的有益效果在于：1、抗冻蛋白的主要功能是热滞效应Thermal hysteresis activity,THA，即降低溶液的冰点，但不改变其熔点，从而产生冰点与熔点之间的温度差值。这种热滞值越大，抗冻蛋白的活性就越高。在所有抗冻蛋白中，昆虫抗冻蛋白具有很高的热滞活性，为鱼类抗冻蛋白热滞活性的3-4倍。因此昆虫抗冻蛋白具有更高的应用价值。2、本专利技术在实验中有明显的效果，我国拥有众多昆虫种类，却很少从其体内发现抗冻蛋白，本专利技术的白蜡虫抗冻蛋白ep-afp正是具备抗冻作用的新的蛋白，该蛋白的热滞活性达到0.91℃，具有很大的应用价值。具体实施方式本实施例中所用的方法均为同领域技术人员公知的方法。本专利技术的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp核苷酸全长序列或其片段采用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成，SEQ ID NO:1具体如下：ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATAAGTCTGTTCCACTCGCTCACTTCATTTCTGCTTTCAAGATTTTCGTTACTCACAAGCAAGGGACTCAAGGGATGATGGATACTGCTTCTAAGGCTACTCTCGATAATCAATTCGGGACTTCTGTTGATGAAGAAGTTATTAAGCAAATTCTCGAACAAGGGAACATGCAATCTTCTGAAATGCTCGATCGTCAAGGGCCAAAGAACGATTCTATGTCTTCTATGAATGCTCGTTAG本专利技术的白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp采用PCR扩增法，根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计特异引物ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTC和CTAACGAGCATTCATAGAAG，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规的cDNA文库作为模板，扩增而得到白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp的核苷酸序列。将该基因克隆至大肠杆菌感受态细胞，一旦获得了该基因的阳性重组克隆，就能够用重组法来大批量地获得该基因。通常是将其克隆入原核表达载体pET-22b，再转入大肠杆菌表达菌株BL21的感受态细胞，然后通过常规的IPTG诱导的方法进行目的基因的原核表达，从增殖后的宿主细胞中分离得到白蜡虫抗冻蛋白。本专利技术的用白蜡虫抗冻蛋白Ep-AFP编码的氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成，SEQ ID NO:2具体如下：用于植物转基因时，根据烟草密码子偏好性对白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp进行修改，得到核苷酸序列SEQ ID NO:3，具体如下：ATGACTCGTGGGGAAGCTTCTCAAATTAAGGTTCACTATAAGGGGAAGGATGAAGATTTCATTGTTCTCGTTGATGATGAAGCTTCTTATAAGAAGTGGCTCGCTGATA本文档来自技高网...
【技术保护点】
白蜡虫抗冻蛋白基因ep‑afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。
【技术特征摘要】
1.白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。2.白蜡虫抗冻蛋白基因ep-afp编码的氨基酸序列由SEQ ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨璞，于淑惠，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院资源昆虫研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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