一种牡丹PsRD22基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种在花芽低温休眠解除过程中持续高表达的基因PsRD22及其编码的蛋白，且进一步设计了该基因的表达分子标记GYRD，首次实现了通过表达分子标记来辅助低温催化牡丹技术；同时通过实验证明了该基因所编码的蛋白能够显著提高植物对干旱胁迫的耐性，为牡丹抗逆育种提供了优秀的候选基因。

【技术实现步骤摘要】
一种牡丹PsRD22基因及其应用
本专利技术属于植物分子生物学、植物基因工程和生物
，涉及一种植物休眠解除响应和抗逆的基因，尤其涉及一种牡丹PsRD22基因及其应用。
技术介绍
牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是中国特有的传统名花，也是世界著名花卉，叶形秀丽，花大色艳，有“花中之王”之美誉。牡丹属芍药科芍药属多年生落叶亚灌木，共有8个原种，分为革质花盘亚组和肉质花盘亚组，均原产于中国。中国既是世界牡丹野生种的原产地和分布中心，也是世界牡丹园艺品种的栽培中心(王莲英，袁涛，《中国牡丹与芍药》，北京金盾出版社，1999)。牡丹产业的发展需要科学理论和技术的支撑和指导。牡丹催花是牡丹产业化的关键技术之一，并且日趋完善。牡丹催花技术是通过人为创造条件使牡丹在自然非开花时节开花的技术。自唐朝开始，就有人尝试牡丹的低温催花。经过1000多年的不断总结与发展，人们已经总结出一套传统的牡丹低温催花技术。但是由于对牡丹花芽内休眠解除机理的认识不足，往往不能彻底打破花芽内休眠，致使花蕾发育不良，造成开花不正常、有花无叶、花小叶小、花期短甚至催花失败(赵海军，张万堂，郑国生等.牡丹深休眠特性和解除方法.山东林业科技，2000，5：44-46)。对牡丹休眠解除过程中关键基因的分析可以从本质上了解牡丹的休眠解除机理，为推进牡丹催花产业奠定基础。干旱应答蛋白RD22(Dehydration-responsiveprotein)是一种被广泛用于检测植物对逆境胁迫响应的标记。最近，RD22被发现在植物休眠过程中也起重要作用。RD22基因是由Yamaguchi-Shinozaki等利用差异显示技术首先从干旱处理的拟南芥中克隆出的9个脱水诱导蛋白基因，命名为RD基因。RD基因家族有很多成员，从干旱、低温、盐胁迫处理的拟南芥中就发现大量的RD基因。使用ABA诱导可检测RD22基因的mRNA，表明RD22基因mRNA的转录可由内源ABA诱导。Northernblotting分析结果表明，RD22基因的表达受盐和水分胁迫诱导，而与冷和热胁迫无关(KazakoYS,MasahiroK,SatomiU,etal.Molecularcloningandcharacterizationof9cDNAsforgenesthatareresponsivetodesiccationinArabidopsisthaliana:sequenceanalysisofonecDNAclonethatencodesaputativetransmembranechannelprotein[J].PlantCellPhysiol,1992,33(3):217-224)。RD22蛋白是包含BURP结构域蛋白家族成员。BURP结构域是由Hattori等界定的氨基酸序列基序。BURP蛋白家族的命名来源于4个具有代表性的成员BNM2、USPs、RD22、PG1蛋白的首字母。目前，发现该结构域仅存在于植物蛋白中，含BURP结构域的蛋白质的氨基酸序列有4个共同特征：N端有一个约20个氨基酸的疏水区，多为信号肽；短保守片段或其他短片段；对于某些BURP-domain类蛋白，还有各自不同的重复序列；C-末端为BuRP结构域。牡丹的遗传背景比较薄弱，对RD22的深入了解可以丰富该物种的生物信息学资源，拓展牡丹分子生物学研究领域，对研究牡丹在特殊生境中的遗传机制有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种牡丹花芽低温休眠解除响应和抗逆基因PsRD22及其编码的蛋白。一方面，本专利技术在建立了上海地区牡丹“洛阳红”花芽低温休眠解除技术平台的基础上，对该过程的转录组进行了动态分析，通过差异表达基因挖掘，分离了一个在花芽低温休眠解除中持续高表达且具有广泛抗逆性的基因PsRD22，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，长度为1140bp，其所编码的PsRD22蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，由379个氨基酸残基组成，分子量为40522道尔顿。具体地，以4年生牡丹“洛阳红”为试验材料，经历0-63天低温处理观测其芽萌动成花情况；以未低温处理的为起始对照，隔7天取样，共10个样本，通过高通量RNA-seq技术建立了花芽低温休眠解除的动态转录组；通过差异表达基因聚类分析，获得了持续高表达的基因PsRD22；通过序列分析及同源性比对发现该基因具有广泛的抗逆性；烟草瞬时转化发现PsRD22主要定位于胞质中，并且在保卫细胞中有较强的荧光信号，参与调控气孔的开闭，从而证实了所获得的基因。进一步，本专利技术还提供了以下各项：1)包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的被分离的DNA分子；2)具有如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链；3)编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸链；4)与SEQIDNo.1所示核苷酸序列互补的多核苷酸链；5)与编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列互补的多核苷酸链；6)包含如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的多核苷酸链的重组表达载体；7)包含上述8)所述的重组表达载体的宿主细胞。在牡丹PsRD22基因的制备过程中，本专利技术根据PsRD22全长cDNA序列设计其上下游的扩增引物为：FGSP5′-atggagcttcatctcctgccct-3′(SEQIDNo.3)；RGSP5′-gttgttggcccagacaatgtga-3′(SEQIDNo.4)。本专利技术还在植物(如拟南芥)中过量表达PsRD22基因，发现其所编码的蛋白质能够显著提高其对干旱胁迫的耐性，可用于改良植物的抗逆性。具体地，通过Gateway技术将PsRD22的编码区(不含终止子)重组至植物表达载体pK7FWG2,0，利用花粉管侵染法获得过表达的转基因拟南芥；与拟南芥Col野生型相比，过表达PsRD22的转基因植株具有显著的抗旱性，因而可用于抗逆种质改造。另一方面，本专利技术还根据PsRD22基因的cDNA序列设计了该基因的表达分子标记GYRD，长度为96bp，其序列如SEQIDNo.5所示，该分子标记可用以检测低温休眠解除过程中PsRD22的表达量，表征休眠解除进程，通过该基因的表达可判断牡丹花芽低温休眠解除的需冷量是否足够，可用于分子辅助低温催化牡丹技术。本专利技术设计的PsRD22表达分子标记GYRD的扩增引物序列如下：GYRD-F5′-caaacccgaatctccagaagctga-3′(SEQIDNo.6)；GYRD-R5′-gaagttgcgcagtacttgtcctca-3′(SEQIDNo.7)。与低温催化牡丹的现有技术相比，本专利技术发现了一种在花芽低温休眠解除过程中持续高表达的基因PsRD22，且进一步设计了该基因的表达分子标记GYRD，首次实现了通过表达分子标记来辅助低温催化牡丹技术；同时通过实验证明了该基因所编码的蛋白能够限制提高植物对干旱胁迫的耐性，为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡丹PsRD22基因，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种牡丹PsRD22基因，该基因为编码SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。


2.一种牡丹PsRD22蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


3.一种分离的DNA分子,其核苷酸序列为编码SEQIDNo.2所示氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。


4.编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的多核苷酸链。


5.与编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列互补的多核苷酸链。


6.包含编码由SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列的多核苷酸链的重组表达载体。


7.包含如权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：高燕，蒋昌华，宋垚，叶康，秦俊，奉树成，
申请(专利权)人：上海植物园，
类型：发明
国别省市：上海;31