用于渗滤的方法技术

在渗滤过程中向收获液流中添加缓冲液会导致浊度增加并且具有其它不理想的效应，包括限制产物回收。提供了与非离子表面活性剂的使用有关的方法和组合物用于改善渗滤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及细胞培养收获微量过滤领域。 相关申请的交互参考本申请要求在2005年1月25日提交的临时美国申请号60/647,184的 优先权，其在本文以其全文引用作为参考。背景在生物技术应用中，才艮据IMt模式，渗滤用于緩冲液交换和产物回收。 在渗滤中，将緩冲液引入循环池或存留池中，同时从系统中移走滤液，渗 滤法可用作洗涤存留物(即产物)，或者用于通过过滤系统洗涤产物用于 收集。微量过滤收获方法的目标是，使用渗滤最大程度地从过程液流中回 收产物.概述本专利技术涉及这样的发现，即将非离子表面活性剂，例如Pluronic F68、 聚乙二醇、或其他非离子嵌段共聚物表面活性剂，添加到在渗滤步骤所使 用的緩冲液中，能够降低生产流体的浊度，所述渗滤步骤是微量过滤法(例 如，切向流过滤；TFF)的一部分.因此，本专利技术包含渗滤的方法。方法 包括提供渗滤的存留物，以及向存留物中添加非离子表面活性剂。非离子 表面活性剂可以是，例如Pluronk^F68或聚乙烯醇(PVA)。在一些实施 方案中，非离子表面活性剂在緩冲液中，例如磷酸緩冲盐溶液(PBS). 緩冲液中非离子表面活性剂的浓度可以在0,2和4 g/L、 0.2和3 g/L、 0.5 和2,5g/L、 0.5和2g/L、 0.5和l,5g/L之间.在一些情况中，緩冲'液中非离子表面活性剂的浓度约为1 g/L或2.5 g/L。在某些实施方案中，存留物 包括细胞和培养基。在本专利技术的某些方面中，渗滤得到的滤液的浊度低于 没有非离子表面活性剂时进行的渗滤。在另一个实施方案中，存在非离子 表面活性剂时从存留物中产物的回收多于没有非离子表面活性剂时产物的 回收。在另一个实施方案中，存留物包含药品，例如重组蛋白质、重组肽、 或天然存在的蛋白质或肽。在某些情况下，存留物包含在存留物中与细胞 等渗的緩冲液，例如PBS。在另一个实施方案中，渗滤在温度约为20"C-25 1C、 2"C到37X:，或2C -25^发生。渗滤可以为，例如不连续渗滤或恒容 渗滤。在某些情况中，非离子表面活性剂的浓度在渗滤过程中没有显著改 变。非离子表面活性剂可以在细胞培养基中。本专利技术还涉^U吏用本文中描述的方法如渗滤产生的产物。另一方面，本专利技术涉及渗滤方法，其包括将非离子表面活性剂(例如， Pluronic F68或PVA)的浓度维持约为1 g/L。另一方面，本专利技术涉及渗滤的组合物，组合物包含大约1 g/L (例如 Pluronic F68)或2.5 g/L (例如PVA)的非离子表面活性剂。组合物还 可以包含等渗緩冲液，例如PBS。除非另外定义，本文中使用的所有冲支术术语和科学术语都采用本专利技术 所属领域普通技术人员普遍理解的相同意义。尽管与本文中描述的类似或 等同的方法和材料可以用于本专利技术实践或测试，适当的方法和材料描述如 下。本文中提到的所有刊物、专利申请、专利，以及其他文献都以其全文 引用作为参考。此外，材料、方法，和实施例都意在说明而非限制。从详细的描述、图表以及权利要求中，将清晰的了解本专利技术的其他特点和优点o详细描述在蛋白质加工过程中，TFF可以作为回收方法的一部分，用于将进样 液流中的完整细胞和细胞碎片与其他成分分离。例如，利用培养的细胞的 生产方法可以〗吏用整合了浓缩和渗滤的收获微量过滤步骤。本方法4吏用例如TFF ，将含有诸如重组蛋白质的产物的细胞培养液从生产细胞系中分离。 经过最初的收获微量过滤(浓缩)后，将一般含有比最初过滤之前更高密 度的细胞的存留物通过过滤系统再循环，并且渗滤以回i!Mt收获微量过滤 系统(渗滤)中被阻挡的额外的产物。对于此渗滤步骤， 一般向存留物中 添加等渗緩沖液(例如PBS)。此渗滤可以使用添加緩冲液的不连续或恒 容方法来进行，通常，术语"过程液流(process stream)"包括进样液流、渗透液流， 和存留液流等，即在过程中含有细胞培养物产物的流动液体。滤液指任何 通过滤器的物质，即渗透液流。"存留物(retentate)"指不通过滤器而 遇到了过滤装置，并重新回流到储池中的物质。"进样液流"指离开储池， 通过泵并注入滤器的物质。上述方法的目标在于使得从细胞培养物或存留物中回收的产品(例如， 分泌的蛋白质或肽产物)的量最大化，同时使得细胞培养物和过程液流中 不需要的物质的量最小化。细胞培养物或存留物中浊度量的升高一般与渗 透物的浊度升高有关，不需要的物质包括例如亚细胞颗粒和碎片。通常， 浊度用作过程液流中不需要物质量的量度。在悬浮着细胞的溶液，如培养 基、緩冲液或两者的混合物中，浊度过量是不理想的，因为浊度指示了这 样的状态，即可以导致滤器阻塞，澄清系统堵塞(例如，通过孔堵塞)， 并对产物质量是有害的(包括通过细胞酶的释放)。在收获的培养物中细 胞的破裂(例如，由于剪切)会导致过程液流浊度的升高。据本文报道， 观察到在渗滤时向存留物中添加緩冲液会增加浊度，即使緩冲液是等渗的。本专利技术涉及到发现与向存留物中单独添加緩冲、;M目比，添加包含非离子表面活性剂(例如，非离子嵌段共聚物表面活性剂如Pluronk^F68或聚乙烯 醇(PVA))的緩冲液(例如PBS)，降低了存留液流和渗透液流中的浊 度量。通常，在添加到存留物中的緩冲液或其他溶液中存在非离子表面活 性剂时，存留物的浊度比没有表面活性剂时降低。另外，滤液的浊度也显 著降低。通常，非离子表面活性剂为Pluronic⑧F68或PVA。其它可用的 非离子表面活性剂包括聚乙二醇(PEG),例如，分子量至少约为1000 的PEG。可以使用具有离子性质但是可以作用为剪切保护剂的某些化合 物，例如右旋葡聚糖。本文描述的方法中使用的右旋葡聚糖的示例性浓度 为至少10g/L。使用本文描述的方法可以鉴定其它适当的化合物。本文描 述的方法中使用的非离子表面活性剂或其它剪切保护剂的浓度一般在0.2 g/L和3 g/L、 0.2 g/L和4 g/L、 0.5 g/L和2 g/L、 0.5 g/L和2.5 g/L、 0.5 g/L 和l,5g/L之间，或约为lg/L。在一些情况中，非离子表面活性剂或其他 剪切保护剂的浓度至少为lg/L或至少为L5g/L。在一些情况中，最大量 不超过2g/L、不超过5g/L，或不超过10g/L。在一些情况中，在开始TFF之前向存留物中加入緩冲液，例如等渗緩 沖液如PBS。该緩冲液一般含有非离子表面活性剂，例如Pluronic F68。在本文描述的方法应用实例中，利用收获微量过滤步骤将含有重组蛋 白质的细胞培养液从生产细胞系中分离，来使用商业化重组蛋白质药物的 生产方法。收获系统为包括0.65 nm微量过滤(MF)膜组件的Prostak 切向流过滤(TFF)装置(Millipore， Billerica， MA)。全细胞培养液(包 含细胞)再循环通过位于TFF系统存留物侧的一系列Prostak组件，并回 流到收获槽中。不含细胞的培养液渗透到0.65 nm Prostak滤器组件膜的另 一侧，并且被收集用于进一步加工。通过最初的TFF方法将全细胞培养液浓缩了 10倍。在过滤系统 (filtration train)存留侧得到的液体就是本文所指的存留物。经过细胞浓 缩之后，以微量过滤后最本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于渗滤的方法，其包括：　　　　ａ）提供用于渗滤的存留物；和　　　　ｂ）向存留物添加非离子表面活性剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J皮尔斯，E莫兰，
申请(专利权)人：惠氏研究爱尔兰有限公司，
类型：发明
国别省市：IE[爱尔兰]