一种马精液冷冻保存液及其配制方法技术

本发明专利技术公开了一种马精液冷冻保存液，由葡萄糖2.00g～2.40g、乳糖3.40g～4.00g、海藻糖0.60g～1.00g、谷胱甘肽0.061～0.092g、柠檬酸钠0.50g～0.70g、脱脂奶30mL～50mL、卵黄液2.5～4.5mL、青霉素5万～10万IU、链霉素5万～10万IU、甘油3.5～5.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。还公开了该冷冻保存液的配制方法。本发明专利技术提供的马精液冷冻保存液，能够有效提高马精液在冻存过程中的存活率和精子活力。解冻后精子生理指标高,现场应用受胎效果稳定可靠,可用于生产。制备方法步骤少、简单易操作，制备条件温和易控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于动物精液冷冻保存技术领 域。
技术介绍
精液冷冻保存是马人工辅助繁殖技术手段之一。1950年，Smith和Polge最早将甘 油作为抗冻剂应用到马精液冷冻保存。1957年，Barker和Gandi er最早利用马附睾冷冻精液 进行配种受孕。中国早在20世纪50年代末就开始进行有关马精液冷冻保存的研究，并取得 了较好的成绩。20世纪80年代，随着阿拉伯马、夸特马、美国花马等品种登记组织允许使用 冷冻精液配种出生的幼驹登记，使得马精液冷冻保存技术得到快速发展。马精液冷冻可扩 大种公马配种范围，减少马生殖道疾病的传播，保护优良遗传资源，能够跨越种族间进行交 配，对完善马的精液冷冻和人工授精配套技术，对于马业的发展、地方优良马品种保存、加 快马品种改良等方面都具有重要的意义。 冷冻保存液是精子的保护剂，对精液冷冻的效果有决定性的影响。目前，国内马精 液的冷冻技术还处于试验阶段，主要原因在于：（1)马精液冷冻过程中冷冻一解冻机理、精 子损伤机理、外部环境变化对精子的影响、精子内部组成物质的变化规律及分子机制等诸 多方面尚不完全清楚；（2)实际操作中的冷冻一解冻程序、稀释液和解冻液的组成不一致， 配制成分、方法复杂，不便于生产中现场配制使用；（3)冷冻精液的活力也难以达到人工授 精要求。以上问题严重制约了马冷冻精液在马育种及商品化生产中的应用。因此，研究一种 马精液冷冻保存液，能够有效提高马精子冻存过程中的存活率和活力，便于冷冻一解冻程 序操作使用，显得尤为必要。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种马精液冷冻保存液，能够有 效提高马精液在冻存过程中的存活率和精子活力，该马精液冷冻保存液的制备方法简单易 实现。 为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案： 一种马精液冷冻保存液，是由葡萄糖2. OOg~2.40g、乳糖3.40g~4. OOg、海藻糖 0 · 60g~1 · 00g、谷胱甘肽0 · 061~0 · 092g、柠檬酸钠0 · 50g~0 · 70g、脱脂奶30mL~50mL、卵黄 液2.5~4.5mL、青霉素5万~10万IU、链霉素5万~10万IU、甘油3.5~5.5mL和双蒸水配制成 1 OOmL马精液冷冻保存液。 进一步地，前述马精液冷冻保存液，是由葡萄糖2.20g、乳糖3.70g、海藻糖0.80g、 谷胱甘肽〇.〇77g、柠檬酸钠0.60g、脱脂奶40mL、卵黄液3.5mL、青霉素10万IU、链霉素10万 IU、甘油4.5mL和双蒸水配制成IOOmL马精液冷冻保存液。 -种马精液冷冻保存液的配制方法，包括以下步骤：（1)配制脱脂奶；（2)配制基础 液I; (3)配制冷冻保存液。 前述马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤： (1)配制脱脂奶:取新鲜马奶过滤后，100°c水浴灭菌IOmin，缓慢降温至室温后，置 于4°C冷藏（能够充分冷却，使脂质漂浮于上层即可），随后离心去除上层脂质和下层沉淀， 得到脱脂奶，其保存时间一般不超过三天； (2)配制基础液I:按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄 液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加 入双蒸水溶解，，定容至IOOmU随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌即得基 础液I; (3)配制冷冻保存液:取基础液I 96 · 5mL~94 · 5mL和甘油3 · 5~5 · 5mL，在基础液I 中加入甘油搅拌20min~40min，即得冷冻保存液。前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤（1)中，离心为：以2000~3000r/min转速 离心20~30min。 前述马精液冷冻保存液的配制方法，具体包括以下步骤： (1)配制脱脂奶:取脱脂奶粉加入双蒸水中，搅拌，配制成浓度为O.lg/mL溶液，得 到脱脂奶； (2)配制基础液I:按量取葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄 液、青霉素和链霉素，先将葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽和柠檬酸钠放入无菌容器中，加 入双蒸水溶解，定容至l〇〇mL，随后加入脱脂奶、卵黄液、青霉素和链霉素，室温搅拌即得基 础液I; (3)配制冷冻保存液:取基础液I 96.5mL~94.5mL和甘油3.5~5.5mL，在基础液I 中加入甘油搅拌20min~40min，即得冷冻保存液。 前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤(2)中，卵黄液通过以下步骤获取:取新 鲜鸡蛋，去除蛋清后，将蛋黄转移到滤纸片上滚动以便除去剩余蛋清和白色的黏着在蛋黄 膜上的卵带，接着把蛋黄膜刺透，卵黄液收集到用冰冷却的容器中。 前述马精液冷冻保存液的配制方法，步骤(2)中，室温搅拌20min~45min得到基础 液I。 一种马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用。前述马精液冷冻保存液在马精液冷冻保存中的应用中，马精液冷冻保存方法包括 以下步骤:取待保存的马精液，加入基础液I进行稀释，马精液与基础液I的体积比为1:1~ 2，其中，基础液I是由葡萄糖、乳糖、海藻糖、谷胱甘肽、柠檬酸钠、脱脂奶、卵黄液、青霉素、 链霉素和双蒸水配制而成，随后在室温条件下，以600 Xg离心力离心8~12min，弃去上清 液，再用冷冻保存液稀释至精子密度为5 X IO7~I X IO8个/mL，混合均匀后，装入0.5mL细管 中，缓慢降温至4°C平衡90~120min，可以使甘油渗入精子体内，产生抗冻保护作用;再在距 离液氮面上4~6cm处熏蒸8~IOmin后(优选距离液氮层面4cm高处），投入液氮中保存。本发 明中通过调整熏蒸高度和时间来控制细管精液的降温速率，熏蒸距离过高或过低、时间过 长或过短，都会使精子受冷打击，造成不可逆转的精子死亡后果。本专利技术中，精液采用假阴道法采精后，用4层灭菌纱布过滤附性腺等胶状物，采精 后进行常规检查，最后取精子活力在0.60以上，密度"中"的精液用于冷冻保存。解冻过程 为:从液氮中取出精液细管，迅速浸入水浴解冻，轻轻摇动至融化。解冻温度为:37°C、30s。 精子在冷冻过程中易发生氧化损伤，氧化损伤是活性氧族（Reactive Oxygen SpeCies，R0S)产生和清除活动不平衡的结果:正常情况下，射出精液精浆(SP)中的抗氧化 物质具有清除ROS的潜力，但精液在冷冻保存过程中，精液离心去除了精浆，使精子失去了 精浆抗氧化剂的保护作用，导致精子易受氧化攻击;另外冷冻过程又能诱导精子产生R0S。 其中有缺陷精子和死精子是冷冻期间ROS的主要来源。ROS能通过氧化不饱和脂肪酸，破坏 质膜脂质双分子结构，引起精子细胞膜功能障碍及内部结构损伤。 糖类是精液冷冻保存液的基本组成部分，既可以为精子代谢提供能量，又是重要 的冷冻保护剂。海藻糖，是由两个葡萄糖分子构成的非还原性糖，性质非常稳定。海藻糖能 够有效地遏制Ca 2+的流动，减缓细胞内外渗透压的瞬间变化，保护细胞膜不被破坏。它还可 以与精子膜上的氢结合，形成一种保护层，在精子膜破裂的情况下能有效地阻止精子内部 有效成分的外流。另外，海藻糖可调控细胞内和溶液之间水分的变化，在冷冻-解冻过程中 保护细胞免受损伤。海藻糖的保护机制与其晶体结构、溶液的物理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种马精液冷冻保存液，其特征在于：由葡萄糖2.00g～2.40g、乳糖3.40g～4.00g、海藻糖0.60g～1.00g、谷胱甘肽0.061～0.092g、柠檬酸钠0.50g～0.70g、脱脂奶30mL～50mL、卵黄液2.5～4.5mL、青霉素5万～10万IU、链霉素5万～10万IU、甘油3.5～5.5mL和双蒸水配制成100mL马精液冷冻保存液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阿娜尔，白东义，赵一萍，房元海，格力格桑，芒来，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15