一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法技术

本申请提供一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法，所述方法包括下述步骤：a.何首乌溶液的制备；b.内毒素溶液的制备；c.动物实验；d.检测指标；e.统计学处理。本申请提供的基于LPS的用于评估何首乌特异质肝毒性的方法可以快速评价何首乌的特异质肝毒性，为何首乌肝毒性评价模型、科学机制的研究以及临床应用提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法
技术介绍
何首乌为蓼科植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的块根，是一味著名的传统补益类中药，广泛用于补肝肾、乌发、降血脂的中药制剂、保健食品，大众日常餐饮、食疗保健，以及洗护发用品等。然而，近年来国内外有关何首乌不良反应的报道大量增加，包括服用生何首乌、制何首乌、含何首乌的复方、中成药或保健食品等。国内外文献报道有关何首乌肝损害病例约150例。2006年，英国和澳大利亚药监部门先后发布了何首乌肝损害警告信息；2013年，我国药监部门也发布了含首乌制剂肝损害警示。正所谓“千年何首乌，今朝肝毒性”，何首乌肝毒性的问题引起国内外的高度关注。何首乌应用广泛，据统计我国含首乌的中成药约500种，保健食品约200种。如果何首乌肝毒性的问题解决不好，将严重影响何首乌及相关产品的临床用药安全，并可能对中药国际声誉和产业健康发展带来巨大的不利影响。因此，亟待阐明何首乌肝毒性的相关科学机制，为临床合理用药、趋利避害提供科学依据。然而，目前基于普通正常动物对何首乌肝毒性的评价结果与临床患者的中毒剂量差异显著。查阅国内多家单位分别独立进行的何首乌肝毒性研究文献表明，何首乌在临床等效剂量做不出对实验动物的肝脏损害，需要在超大剂量(40-60g生药/kg)、长期给药(4-12周)情况下才能引起大鼠肝损害。但实际上，何首乌在临床应用过程中出现肝中毒的患者，许多并没有超剂量服用，服用剂量是在药典规定范围(生首乌3-6g/日)之内。药物的肝脏毒副反应可分为固有肝毒性(intrinsichepatotoxicity)和特异质肝毒性(idiosyncratichepatotoxicity)两类，其中前者是指药物肝损害发生与剂量、时间正相关，用药个体间差异不明显；而后者是指药物肝损害发生存在显著个体差异，仅有部分人群会发生。尽管何首乌致肝损害的准确发病率数据尚不清楚，根据国家不良反应中心的数据，以及302医院药物性肝损害临床数据库的统计，推测何首乌肝损害的总体发病率较低，因此考虑何首乌肝损害可能类似于特异质肝毒性。有关何首乌特异质肝毒性的评价研究尚未见报道。特异质肝毒性的发生往往和剂量、用药时间无关，难以预测。特异质肝毒性评价模型一直是国内外毒理学研究的热点和前沿课题。目前，关于特异质肝毒性发生的机制还不完全清楚，许多研究表明，采用联合内毒素如细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)免疫预干预的动物模型与临床药物特异质肝毒性较为近似。然而，有关何首乌是否可以利用LPS进行特异质肝毒性评价的方法尚未见报道。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法。具体的，本申请提供一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法，所述方法包括下述步骤：a.何首乌溶液的制备制备何首乌的干燥提取物，计算收率；测试时，按照何首乌的给药剂量计算所需干燥提取物的量，采用无菌蒸馏水溶解，贮存，优选地在4℃下贮存，备用；b.内毒素溶液的制备按照内毒素的给药剂量计算所需内毒素的量，采用无菌蒸馏水溶解，贮存，优选地在4℃下贮存，备用；c.动物实验将大鼠随机分组，实验前称重并记录，通过灌胃给予大鼠所述何首乌溶液，之后，尾静脉注射内毒素溶液，然后，麻醉大鼠，下腔静脉取血，离心，采集血浆标本；d.检测指标用酶标仪法检测血浆标本的肝功能指标血清丙氨酸氨基转氨酶(ALT)和天冬氨酸氨基转氨酶(AST)；e.统计学处理采用SPSS软件对ALT和AST进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。当然，本领域的技术人员将理解的是，还可以采用其它统计学处理软件来进行数据分析。在一些实施方式中，所述干燥提取物可以通过以下制备：称取何首乌饮片，用溶剂在室温下冷浸提取，提取液真空浓缩以除去溶剂，真空干燥，得到干燥提取物；在一些实施方式中，所述何首乌饮片的直径可以为约1cm。在一些实施方式中，所述溶剂可以为乙醇，优选地，所述溶剂可以是体积百分数为50％的乙醇。在一些实施方式中，所述溶剂的以毫升计的体积可以为所述何首乌饮片的以克计的重量的5-15倍。在一些实施方式中，冷浸时间可以为12-72小时。在一些实施方式中，所述干燥提取物可以通过以下制备：称取何首乌的饮片，加入体积百分数为50％的乙醇冷浸提取，其中乙醇的以毫升计的体积为所述何首乌饮片的以克计的重量的8倍，冷浸提取2次，每次48h，合并提取液，减压浓缩回收尽乙醇，真空干燥，得到干燥粗提物。在一些实施方式中，所述内毒素可以为细菌脂多糖。在一些实施方式中，可以使用戊巴比妥钠麻醉大鼠。在一些实施方式中，在动物实验中，何首乌给药剂量可以为0.54g/kg～75.6g/kg优选地，1.08g/kg～50.4g/kg为导致肝毒性范围。其中，在本申请中，何首乌给药剂量的单位g/kg是指每kg大鼠的体重给予以g计算的何首乌生药量，比如0.54g/kg是指每kg大鼠的体重给予0.54g何首乌生药量。其中，何首乌生药量可以通过以下计算：称取的何首乌的饮片的重量×收率。在一些实施方式中，在动物实验中，内毒素给药剂量可以为1.4mg/kg～5.6mg/kg。优选地，内毒素给药剂量可以为1.4mg/kg～2.8mg/kg。在一些实施方式中，在动物实验中，可以在给予何首乌溶液2～5小时后，向大鼠尾静脉注射内毒素溶液。优选地，可以在给予何首乌溶液2～4小时后，向大鼠尾静脉注射内毒素溶液。在一些实施方式中，在动物实验中，可以在注射内毒素溶液7～10小时后，麻醉大鼠；优选地，可以在注射内毒素溶液7～9小时后，麻醉大鼠。在一些实施方式中，实验所用的大鼠可以为Wistar大鼠、SD大鼠或F344大鼠，优选地可以为SD大鼠。在一些实施方式中，所述大鼠的体重可以为150g～300g。优选地，所述大鼠的体重可以为200g～250g。本申请采用目前较广泛采用的基于内毒素的特异质肝毒性动物模型，考察何首乌对大鼠肝脏的损伤作用及其量-毒关系，以期为何首乌肝毒性评价模型和科学机制的研究提供参考。与现有的何首乌肝毒性评价方法相比，本申请的用于评估何首乌特异质肝毒性的方法具有如下优点：1)本申请基于LPS的用于评估何首乌特异质肝毒性的方法可以评价何本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法，所述方法包括下述步骤：a.何首乌溶液的制备制备何首乌的干燥提取物，计算收率；测试时，按照何首乌的给药剂量计算所需干燥提取物的量，采用无菌蒸馏水溶解，贮存，优选地在4℃下贮存，备用；b.内毒素溶液的制备按照内毒素的给药剂量计算所需内毒素的量，采用无菌蒸馏水溶解，贮存，优选地在4℃下贮存，备用；c.动物实验将大鼠随机分组，实验前称重并记录，通过灌胃给予大鼠所述何首乌溶液，之后，尾静脉注射内毒素溶液，然后，麻醉大鼠，下腔静脉取血，离心，采集血浆标本；d.检测指标用酶标仪法检测血浆标本的肝功能指标血清丙氨酸氨基转氨酶ALT和天冬氨酸氨基转氨酶AST；e.统计学处理采用SPSS软件对ALT和AST进行统计分析，计量资料采用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义。

【技术特征摘要】
1.一种用于评估何首乌特异质肝毒性的方法，所述方法包括下述步
骤：
a.何首乌溶液的制备
制备何首乌的干燥提取物，计算收率；
测试时，按照何首乌的给药剂量计算所需干燥提取物的量，采用无菌
蒸馏水溶解，贮存，优选地在4℃下贮存，备用；
b.内毒素溶液的制备
按照内毒素的给药剂量计算所需内毒素的量，采用无菌蒸馏水溶解，
贮存，优选地在4℃下贮存，备用；
c.动物实验
将大鼠随机分组，实验前称重并记录，通过灌胃给予大鼠所述何首乌
溶液，之后，尾静脉注射内毒素溶液，然后，麻醉大鼠，下腔静脉取血，
离心，采集血浆标本；
d.检测指标
用酶标仪法检测血浆标本的肝功能指标血清丙氨酸氨基转氨酶ALT
和天冬氨酸氨基转氨酶AST；
e.统计学处理
采用SPSS软件对ALT和AST进行统计分析，计量资料采用单因素方
差分析，P＜0.05为有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干燥提取物通过以下制
备：
称取何首乌的饮片，加入体积百分数为50％的乙醇冷浸提取，其中乙
醇的以毫升计的体积为所述何首乌饮片的以克计的重量的8倍，冷浸提取
2次，每次48h，合并提取液，减压浓缩回收尽乙醇，真空干燥，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伽伯，肖小河，李春雨，马致洁，赵艳玲，柏兆方，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇二医院，
类型：发明
国别省市：北京;11