一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，当用激发光扫描物体的某一点时，用探测器阵列记录到该点在像面上成的艾里斑的光强信息，通过对其加载不同的数字图样可对该阵列信息进行虚拟波矢调制，再将阵列的所有点光强相加作为该扫描点的图像信息；原本被成像系统带宽所截止的样品信息的高频成分被编码于调制后的图像信息中；对样品二维扫描后，得到物体经过虚拟波矢调制后的图像；然后通过迭代算法从调制后的图像中重构出物体的超分辨图像。本发明专利技术还公开了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微装置。本发明专利技术采用探测器阵列，通过虚拟波矢调制的方法除了可获得同等的背景噪声的抑制效果，还可获得了更高的横向分辨率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于共聚焦显微领域，特别涉及一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法及装置。
技术介绍
共聚焦显微镜利用激光束经光学系统形成的点光源对样品内物镜焦平面的每一点进行扫描。样品上的被照射点，在探测针孔处成像，而焦平面以外的点不会在探测针孔处成像。样品上被照射点的图像信息由探测针孔后的光电探测器逐点接收，迅速在计算机监视屏上形成荧光图像。例如，公开号为CN102830102A的专利文献提供的一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成空心聚焦光斑并激发荧光；对所述待测样品的表面进行扫描并收集激发荧光，获取不同位置的光强度信息，并计算得到相应的显微图像。但根据衍射理论，显微镜的分辨能力与波长和数值孔径有关，减小波长和增大数值孔径都能提高分辨率，但都无法突破衍射极限，不能真正大幅度地提高分辨率。从1990年起，荧光超分辨显微镜被广泛应用在生物细胞成像中，包括受激辐射损耗显微镜(STED)、荧光辐射差分显微镜(FED)、光敏定位显微镜(PALM)、随机光学重构显微镜(STORM)和结构光照明显微镜(SIM)。这些荧光超分辨显微方法都能实现超分辨成像，但同时存在三大类问题：(1)有限的荧光标记物质；(2)噪声及像差；(3)低光学切片能力。
技术实现思路
本专利技术在共聚焦显微镜的基础上，提出了一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法及装置，在通用的共聚焦显微镜装置基础上，用一个探测器阵列代替传统的点探测器，将探测器阵列置于物方焦平面来接受样品的图像信息。当用激发光扫描物体的某一点时，用探测器阵列记录到该点在像面上成的艾里斑的光强信息，通过对其加载不同的数字图样可对该阵列信息进行虚拟波矢调制，再将阵列的所有点光强相加作为该扫描点的图像信息。由此，原本被成像系统带宽所截止的样品信息的高频成分被编码于调制后的图像信息中。对样品二维扫描后，得到物体经过虚拟波矢调制后的图像。本专利技术设计了一种独特的迭代算法，从调制后的图像中重构出物体的超分辨图像，并复原出激发光路的光学传递函数。本专利技术的具体技术方案如下：一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，针对荧光样品(被两类荧光蛋白标记)包括以下步骤：(1)激光器发出激发光束，首先经第一透镜准直，经第一反射镜反射、第一二色镜反射后进入扫描振镜系统；经扫描振镜系统导向的激发光再经扫描镜后在聚焦于扫描镜后焦面；聚焦于扫描镜后焦面的激发光再经过场镜和显微物镜聚焦于物体上的一点；扫描振镜系统扫描时候，在扫描镜的后焦面上形成扫描区域，场镜和显微物镜共同构成一个成像系统扫描镜后焦面上的扫描区域成像于物体上；(2)当激光聚焦于所述荧光样品的某一点时，该点被激发光激发发射荧光被显微物镜收集，再经过场镜、扫描镜后返回入扫描系统；经过扫描系统返回来的荧光再经第一二色镜透射后，经滤波片滤除散射光，再经放大系统放大，将样品上该点发出的艾里斑成像于探测器阵列；(3)所述探测器阵列将光信号转换为电信号并传给计算机，计算机用余弦分布的数字图样对探测到的阵列信息进行虚拟波矢调制，再将调制后的阵列强度全部相加作为物体该点的图像信息，由此对样品的每一个点都可得到一个经过虚拟波矢调制后的强度信息。通过扫描振镜对物体进行二维扫描，最终可得到一幅经过虚拟波矢调制的物体图像；(4)用具有不同空间频率的余弦分布的数字图样调制阵列信息，会得到含有物体不同频谱成分的图像；本专利技术设计了一套独特的迭代算法将物体的高频信息解调出来重构出物体的超分辨图像，同时可通过迭代算法复原出激发光路的光学传递函数；(7)通过控制z轴压电平台，可得到样品不同深度的调制图像，再通过迭代算法解调可得到样品不同深度的二维超分辨图像，从而重构出样品的三维超分辨图像。本专利技术还提供了一种基于虚拟波矢调制的荧光发射微分显微装置，针对荧光样品包括：激光器，用于发出激发光束，实现对荧光样品的照明激发；透镜，用于对激发光束进行准直；反射镜，用于反射准直后的激发光束；二色镜，用于反射激发光束和透射样品发射出的荧光；扫描振镜，通过控制扫描振镜使得激发光束聚焦在样品的不同点上激发荧光，同时使发出的荧光返回聚焦在探测器位置，实现对样品的二维扫描；扫描镜，用于形成扫描区域；场镜，与显微物镜共同构成成像系统将扫描区域成像在样品上；显微物镜，用于将激发光聚焦于样品上，并收集样品激发出的荧光；滤波片，滤除收集到的荧光中的散射光；放大系统，将物点的艾里斑的像放大成像于探测器阵列上；探测器阵列，用于记录每扫描一个点时焦面上的艾里斑信息；计算机，用于记录探测器阵列信息，对其进行数字调制，并通过迭代算法解调出样品高频信息，重构出高分辨率图像和激发光路系统的光学传递函数。z轴压电平台：用来控制样品高度，从而使得激发光对样品不同深度的截面进行二维扫描；本专利技术中，扫描振镜和z轴压电平台的作用可由三维平移台替代，用于样品的二维扫描以及改变扫描深度。本专利技术中，探测器阵列包括多个探测器单元，各探测器紧密排布，排列方式包括但不仅限于矩形阵列和蜂窝状阵列，例如6×6方形阵列。本专利技术原理如下：在通用的振镜扫描的共聚焦显微镜装置基础上，用一个探测器阵列代替传统的点探测器，置于物方焦平面来接受样品的空间信息。当用激发光扫描物体的某一点时，用探测器阵列记录到该点在像面上成的艾里斑的光强信息，并通过加载数字图样的方式对该阵列信息进行虚拟波矢调制，再将调制后的光强阵列相加作为该扫描点的图像信息。对被测样品进行二维扫描，即可得到一幅经过虚拟波矢调制的物体的二维图像。用具有不同空间频率的余弦分布的数字图样调制阵列信息，会得到含有物体不同频谱成分的图像；再通过一套独特的迭代算法将物体的高频信息解调出来重构出物体的超分辨图像和激发光路的光学传递函数。具体原理阐述如下：当物面上的某点r被激发时，如果不使用振镜，成像面的探测器阵列接收到的强度分布为Inon-descan(rd；r)＝∫hex(rs-r)s(rs)hde(rd-rs)drs(1)式中，rd，rs分别表示探测平面和样品面的坐标，s表示样品的空间分布，hex和hde分别表示激发光路和探测光路的点扩散函数。当荧光信号被振镜导回时，像面的探测器阵列接收到的强度分布可以通过给Inon-descan加载一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用激发光束对荧光样品进行激发，并通过探测器阵列收集所激发荧光的光强信息；2)用余弦分布的数字图样对探测到的光强信息进行虚拟波矢调制，再将调制后的强度信息相加作为样品扫描点的图像信息；3)对荧光样品进行二维扫描，得到一幅经过虚拟波矢调制的样品图像；4)重复步骤2)和步骤3)中的操作，并采用具有不同空间频率的余弦分布的数字图样调制所述的光强信息，得到含有样品不同频谱成分的图像；5)利用迭代算法将所述图像中样品的高频信息解调出来，以重构样品的二维超分辨图像。

【技术特征摘要】
1.一种基于虚拟波矢调制的荧光超分辨显微方法，其特征在于，包
括以下步骤：
1)采用激发光束对荧光样品进行激发，并通过探测器阵列收集所激
发荧光的光强信息；
2)用余弦分布的数字图样对探测到的光强信息进行虚拟波矢调制，
再将调制后的强度信息相加作为样品扫描点的图像信息；
3)对荧光样品进行二维扫描，得到一幅经过虚拟波矢调制的样品图
像；
4)重复步骤2)和步骤3)中的操作，并采用具有不同空间频率的余
弦分布的数字图样调制所述的光强信息，得到含有样品不同频谱成分的图
像；
5)利用迭代算法将所述图像中样品的高频信息解调出来，以重构样
品的二维超分辨图像。
2.如权利要求1所述的荧光超分辨显微方法，其特征在于，所述的探
测器阵列为6×6方形阵列，每个探测器对应一个光强信息。
3.如权利要求1所述的荧光超分辨显微方法，其特征在于，所述数字
图样的表达式为：
p(n)(r)=12[1+cos(kp(n)·r)]]]>式中，r为样品的空间坐标，n表示不同数字图样的编号，kp(n)为第n
张余弦分布的数字图样的空间频率。
4.如权利要求1所述的荧光超分辨显微方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，方月，马也，刘旭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33