本发明专利技术涉及辅助诊断领域，具体涉及一种用于区分恶性浆膜腔积液中间皮细胞与癌细胞的酸性磷酸酶染色法、相关试剂及其应用。本发明专利技术的染色方法能够去除样品中的红细胞，消除背景影响，同时，能够将间皮细胞和恶性肿瘤细胞明显区分，帮助医生迅速准确的找到恶性肿瘤细胞，并借此进一步作出诊断，极大提高了诊断的准确性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及辅助诊断领域，具体涉及一种用于区分恶性浆膜腔积液中间皮细胞与癌细胞的酸性磷酸酶染色法、相关试剂及其应用。
技术介绍
浆膜腔是浆膜壁层和脏层之间的间隙，分为胸膜腔、腹膜腔、心包腔等。腔内有少许浆液，起润滑作用，病理情况下可增多，形成胸水、腹水、心包积液等。临床送检的浆膜腔积液均属病理性，浆膜腔积液内的细胞成分包括间皮细胞、非上皮来源的血液细胞，还可能存在肿瘤细胞。良性病变(如肺炎、肺梗死、流感、肝脓肿、结核病、心衰等等)或恶性病变(肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、恶性间皮瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、消化系统肿瘤等等)都可以引起浆膜腔积液。2014年世卫组织最新数据显示，肺癌已成为中国癌症死因之首，同时也是中国男性最常见的癌症，2014年中国有超过60万人死于肺癌。约50%以上的肺癌患者在疾病过程中将出现胸腔积液。9年来前六位的肿瘤分别是:肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠肛门癌、乳腺癌，占所有报告病例的65%以上。引起恶性腹水的原发病以卵巢癌和肝癌最常见，占30%?54%，其他可由胃肠道肿瘤、胰腺癌、子宫癌等引起，10%?15%胃肠道肿瘤可发生恶性腹水，腹腔外恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌和淋巴瘤等也可引起。此外，15-20%的患者原发病灶不明。而临床的随机胸腹水样本中，25%左右为恶性。脱落细胞学检查因具有快速、简便、易行、可重复检查以及患者痛苦少等优点，在临床上得以广泛应用，目前是恶性胸腹水诊断的基本方法。细胞学检查依据细胞的形态学特征作出判断，而浆膜腔中的间皮细胞由于增生、变性等原因导致形态多样，仅通过巴氏染色从形态上不容易与癌细胞区分，所以浆膜腔积液的脱落细胞学检查经常存在较低的敏感性(40% -60% )，经验不足的病理医生甚至无法做出判断。因此如何减少浆膜腔积液细胞学诊断的假阴性、假阳性率，避免漏诊、误诊，提高阳性率具有重要的实际意义，这也是目前亟待解决的问题。【附图说明】图1鳞状细胞癌患者胸水染色结果:图中右侧见数个鳞癌细胞呈片状排列，细胞大小不等，核形不规则，呈阴性反应。而左侧反应性间皮细胞呈强阳性反应，细胞质中出现红色颗粒。图2腺癌患者腹水染色结果:图中左上及左下两团腺腔样排列的腺癌细胞，呈阴性反应，而周围反应性间皮细胞呈强阳性反应，淋巴细胞酸性磷酸酶染色为阴性。图3肺小细胞癌患者心包积液染色结果:图中央数个小细胞型癌细胞拥挤样排列，呈阴性反应，而周围散在分布的反应性间皮细胞呈强阳性反应。
技术实现思路
本专利技术以酸性磷酸酶催化的特异性反应为基础，在细胞质中生成的红色颗粒为标记，从分子层次区分间皮细胞和癌细胞，本专利技术的方法操作简便，稳定性好，保证了诊断的特异性和灵敏度。同时能够帮助医生迅速找到病变细胞，医生在诊断时只需观察酸性磷酸酶阴性的细胞进行形态学观察，减少医生的工作量。经过长时间的研究和分析，我们发现，使用酸性磷酸酶染色法，能够将恶性浆膜腔积液中的间皮细胞染成红色(即间皮细胞为酸性磷酸酶染色阳性)，而恶性肿瘤细胞不能被染色(即恶性肿瘤细胞为酸性磷酸酶染色阴性)。通过对恶性浆膜腔积液脱落细胞染色可以将间皮细胞和恶性肿瘤细胞明显区分，能够帮助医生迅速准确的找到恶性肿瘤细胞，并借此进一步作出诊断，极大提高了诊断的准确性，尤其对于形态、大小均与间皮细胞极为相似的恶性肿瘤细胞，该染色方法能够将两者显著区分，有助于医生进行下一步的具体诊断和得出准确的诊断结果。且在研究过程中研究人员发现，使用10%福尔马林溶液用作固定液能够清除浆膜腔积液中红细胞，避免了红细胞对医生诊断造成影响，而使用其他成分的固定液却不能达到有效清除红细胞的效果。具体实施例实施例1:—、酸性磷酸酶染色试剂盒成分:(1)固定液:5-10%福尔马林(2)染色液:5-20g/l萘酚AS-ΒΙ磷酸盐溶于二甲基甲酰胺(3)盐酸品红:2-10%盐酸品红(4)亚硝酸钠:0.1-0.4M NaN02(5)醋酸钠溶液:2-5M，pH 4.5-5.5(6)蒸馏水(7)核复染液:苏木素2.5g，无水酒精20ml，硫酸铝钾5g，蒸馏水330ml，碘酸钠250mg，甘油 150ml，冰醋酸 10ml。此外，上述试剂盒中还可以包含酶标液基细胞学保存液，其具体组成如下所示:(1)15% 甲醇(2) 0.1mM EDTA(3) 0.1mM NaCl(4) 0.01M 醋酸钠缓冲液，pH 5.2(5)5% Proclin 300(6)dd H20o二、染色步骤:(1)细胞涂片制片:常规抽取的胸腹水或心包积液约15ml，2000rpm离心lOmin，小心移去上清，取上层细胞涂片，待细胞半干；或液基细胞制片:常规抽取的胸腹水或心包积液约15ml，2000rpm离心lOmin，小心移去上清，应用酶标液基细胞学保存液洗涤并制片，待细胞半干；(2)固定:半干的细胞涂片置于固定液中常温固定4min，可以去除红细胞；(3)自来水流水冲洗2min;(4)酸性磷酸酶染色:25ml蒸馏水中加入0.5ml盐酸品红溶液、1.5ml萘酚溶液、0.5ml亚硝酸钠溶液、1.5ml醋酸钠溶液，作为酸性磷酸酶染色液，将细胞涂片置于上述酸性磷酸酶染色液中，37摄氏度染色5-10min ;(5)自来水流水冲洗2min;(6)核复染液中染色5min ；(7)自来水流水冲洗2min;(8)彻底风干后中性树胶封片。三、染色结果:固定液兼有破碎红细胞功能，红细胞被去除，背景干净，易于观察；研究中，研究人员使用其他固定液对浆膜腔积液同样进行上述染色方法，结果表明，使用其他固定液并不能够去除红细胞，造成较大的背景污染，对诊断检查造成困扰。同时，图1-3结果表明，浆膜腔积液中间皮细胞酸性磷酸酶表达水平高，染色阳性，在细胞质中出现大量红色颗粒；肿瘤细胞、淋巴细胞、白细胞酸性磷酸酶染色阴性，所有细胞的细胞核呈蓝色。新鲜或保存较好的样本中间皮细胞染色更强。说明本专利技术的染色方法能够显著的将浆膜腔积液中的间皮细胞与恶性肿瘤细胞等区分开来，有助于医生做出准确的医学诊断结果。四、临床研究结果:中国医科大学第一附属医院和安徽省立医院的临床研究结果有力的证明了产品敏感性高、特异性强、假阴性率低的特点。我们在2014年至2015年期间从中国医科大学第一附属医院和安徽省立医院就诊的门诊病人随机收集病例151例，最终的组织学结果确认31例为恶性浆膜腔积液，120例为非恶性。其中中国医科大学第一附属医院取得病例101例，应用细胞涂片制片；而安徽省立医院取得50例，应用液基制片法制片。所有样本按照上述酸性磷酸酶染色法与普通巴氏染色法对照进行细胞学检查，将所有样本交由5位经验丰富的病理医生先后进行诊断。细胞学诊断结果是，应用酸性磷酸酶染色准确率为96±4%，平均用时2.25小时，巴氏染色为73 ± 17 %，平均用时3.75小时。酸性磷酸酶染色法在鉴定恶性浆膜腔积应用中液显示出明显的优越性。【主权项】1.一种用于区分恶性浆膜腔积液中间皮细胞与癌细胞的酸性磷酸酶染色试剂盒，所述试剂盒包括固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、核复染液、蒸馏水。2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的具体组成如下所示: (1)固定液:5-10%福尔马林 (2)染色液:5-20g/l，萘酚AS-ΒΙ磷酸盐溶于二甲基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于区分恶性浆膜腔积液中间皮细胞与癌细胞的酸性磷酸酶染色试剂盒，所述试剂盒包括固定液、染色液、盐酸品红、亚硝酸钠、醋酸钠溶液、核复染液、蒸馏水。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴广平，王阳，方圣云，方圣文，
申请(专利权)人：合肥锦慈康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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