可发生光点击化学反应的小分子RNA及其制备方法和应用技术

可发生光点击化学反应的小分子RNA及其制备方法和应用，结构如下：本发明专利技术结合光点击化学反应实现对siRNA和miRNA的荧光标记、分子修饰、靶点分离鉴定、其他相互作用生物分子的分离鉴定以及以此对siRNA和miRNA药物应用中毒副作用的评估。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于光点击化学反应
，具体涉及可发生光点击化学反应的小分子 RNA及其制备方法和应用。
技术介绍
在哺乳动物细胞中，核糖核酸干扰（RNAinterference，RNAi)是一种广泛和基 础的生物过程，并在生理病理过程中起着决定性的作用。在RNAi过程中，小分子非编码 RNA，如内源性的微小核糖核酸（microRNA，miRNA)和外源性的小干扰核糖核酸（small interferingRNA，siRNA)可通过碱基互补配对的原则使它们的祀信使核糖核酸（mRNA) 被降解或抑制它们的翻译，这种广泛的对靶基因表达的调控过程与疾病的发生发展密切相 关。因而，siRNA和miRNA近年来已经被视为可通过RNAi实现治疗目的的一类新型的先导 药物。然而，siRNA和miRNA的药物作用机制包括在体内运输、体内分布、作用靶点、相互作 用的其他生物分子、可能的毒副作用等仍然处于未知阶段，亟需发展一类新型方法解决以 上siRNA和miRNA药物应用中未知的问题。 光点击化学反应是一类新型的生物正交反应，可实现对生物大分子的修饰和荧光 标记。本专利技术中，专利技术人发现了可利用光点击化学反应实现对siRNA和miRNA的荧光标记、 分子修饰、靶点分离鉴定、其他相互作用生物分子的分离鉴定以及以此对siRNA和miRNA药 物应用中毒副作用的评估。
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供可发生光点击化学反应的小分子RNA及其制备方法 和应用，结合光点击化学反应实现对siRNA和miRNA的荧光标记、分子修饰、靶点分离鉴定、 其他相互作用生物分子的分离鉴定以及以此对siRNA和miRNA药物应用中毒副作用的评 估。 技术方案：可发生光点击化学反应的小分子RNA，结构如下： 其中RNA代表任意的siRNA或miRNA，X为二硫键、酰胺键、酯键或醚键，且X连接 在siRNA或miRNA的正义链或反义链的3'端或5'端，Y为含一至十个碳的烷基、低聚或多 聚乙二醇，Z为二硫键、酰胺键、酯键、醚键、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇中的任 意一种，Tet为可发生光点击化学反应的四氮唑类化学小分子，其化学结构如下： 其中ArJPAr2为苯环或萘环，R「1?14分别为氢、氮、氧、硫、含有一至十个碳的烷基、 低聚或多聚乙二醇、烯丙基、炔丙基、叠氮、酰基或酯基、3-烯丙氧基或4-烯丁氧基，Z连接 在Ar^Ar2的任意位置上。所述RNA为miR-122。 所述Tet为 所述可发生光点击化学反应的小分子RNA的结构式为：所述可发生光点击化学反应的小分子RNA的制备方法，工艺路线为：.〇 上述方法优选为，采用琥珀酰亚胺活化小分子化合物的羧基，再与修饰有氨基的 RNA进行缩合，其反应体系为pH= 7. 4的DMS0/PBS。 上述小分子RNA在标记、成像中的应用。 上述小分子RNA在其靶信使核糖核酸分离鉴定中的应用。 上述小分子RNA在制备核糖核酸干扰药物中的应用。 上述小分子RNA在鉴定与其相互作用的不同生物分子中的应用。 本专利技术采用现代分子生物学和化学生物学的方法研究四氮唑类小分子修饰的 siRNA和miRNA在核糖核酸干扰中的应用。 (一）四氮唑类化学小分子的合成 四氮唑类化学小分子合成的合成路线为：(二）siRNA和miRNA的修饰 (三）siRNA和miRNA的标记 通过四氮唑类化学小分子与双键修饰的功能分子之间的光点击化学反应实现对 siRNA和miRNA不同的功能性的修饰。 (四）荧光素酶实验 通过四氮唑类化学小分子修饰的siRNA和miRNA刺激细胞内的荧光素酶信号变化 判断其的生物活性，具体流程如下： (1)构建含有siRNA或miRNA结合位点的荧光素酶质粒； (2)将质粒和四氮唑类化学小分子修饰的siRNA和miRNA共转染到细胞中； (3)测定荧光素酶信号。 (五）拉下实验 结合光点击化学反应，将生物素连接到siRNA和miRNA上，并利用生物素与链霉素 间强亲和作用对细胞内与siRNA和miRNA作用的生物分子进行分离，并对其进行相应的鉴 定。具体流程如下： (1)将四氮唑类化学小分子修饰的siRNA或miRNA转染到细胞中； (2)在细胞裂解，通过光点击化学反应将生物素连接到siRNA或miRNA上； (3)将得到的siRNA或miRNA与带有链霉素的磁珠作用，使siRNA或miRNA及与之 相互作用的生物分子固定到磁珠表面； (4)分离磁珠上的生物分子； (5)利用荧光定量PCR对分离的siRNA或miRNA进行分析定量； (6)利用荧光定量PCR对分离的与siRNA或miRNA相互作用的靶信使核糖核酸进 行分离鉴定； (7)对与siRNA或miRNA相互作用的蛋白进行电泳分离，蛋白印迹分析或银染分 析、蛋白质谱分析。 (六）siRNA和miRNA的荧光成像 通过光点击化学反应对活细胞内的siRNA和miRNA进行荧光成像，具体流程如 下： (1)将四氮唑类化学小分子修饰的siRNA或miRNA转染到细胞中； (2)用双光子激发四氮唑的分子内光点击化学反应； (3)对siRNA或miRNA进行荧光成像。 (七）细胞凋亡检测 测定通过光点击化学反应标记的siRNA和miRNA刺激后细胞活力，具体流程如 下： (1)用标记的siRNA和miRNA转染到细胞内对细胞进行刺激； (2)利用流式细胞仪对细胞凋亡进行测定。 有益效果：本专利技术提供可发生光点击化学反应的小分子RNA及其制备方法和应 用，结合光点击化学反应实现对siRNA和miRNA的荧光标记、分子修饰、靶点分离鉴定、其他 相互作用生物分子的分离鉴定以及以此对siRNA和miRNA药物应用中毒副作用的评估。【附图说明】 图1为四氮唑类化合物1的核磁氢谱； 图2为四氮唑类化合物1的核磁碳谱； 图3为四氮唑类化合物2的核磁氢谱； 图4为四氮唑类化合物2的核磁碳谱； 图5为四氮唑类化合物3的核磁氢谱； 图6为四氮唑类化合物3的核磁碳谱； 图7为四氮唑类化合物1修饰miR-122的荧光素酶实验结果； 图8为四氮唑类化合物1修饰miR-122的下拉实验中miR-122分析结果； 图9为四氮唑类化合物1修饰miR-122的下拉实验中miR-122的靶mRNA分析结 果； 图10为四氮唑类化合物1修饰miR-122的下拉实验中miR-122的相互作用蛋白 (AG02)分析结果； 图11为四氮唑类化合物2和3修饰miR-122的荧光成像结果。【具体实施方式】 实施例1、四氮唑化学小分子1的合成 (1)化合物la(1. 5g，lOmmol)和对甲基苯磺酰肼（1. 86g，lOmmol)溶于甲醇 (50mL)及水（50mL)中，室温搅拌5分钟，析出大量白色固体，过滤得lb3g(产率93%)。 (2)苯胺重氮盐是通过将2mL冷的亚硝酸钠溶液（5mmol)在5°C以下倒入含有 1. 3mL浓盐酸（37. 5wt. % )的苯胺（5mmol)的50vt. %乙醇水溶液中制备得到。将重氮盐 滴加到30mL溶有lb(1. 6g，5mmol)的吡啶溶液中，控制反应温度在-10°C至-15°C。滴加完 全后继续反应3小时后，用二氯甲烷和水萃取反应，有机层合并后用稀本文档来自技高网...

【技术保护点】
可发生光点击化学反应的小分子RNA，其特征在于结构如下：其中RNA代表任意的siRNA或miRNA，X为二硫键、酰胺键、酯键或醚键，且X连接在siRNA或miRNA的正义链或反义链的3’端或5’端，Y为含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇，Z为二硫键、酰胺键、酯键、醚键、含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇中的任意一种，Tet为可发生光点击化学反应的四氮唑类化学小分子，其化学结构如下：其中Ar1和Ar2为苯环或萘环，R1‑R14分别为氢、氮、氧、硫、含有一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、烯丙基、炔丙基、叠氮、酰基或酯基、3‑烯丙氧基或4‑烯丁氧基，Z连接在Ar1或Ar2的任意位置上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳，张辰宇，李金波，黄磊，肖潇，周正权，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32