本发明专利技术涉及一种哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN及其制备方法和用途，其中哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN的氨基酸序列为SEQ ID No.1和2，编码哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3。本发明专利技术的哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN具有抗菌活性，能够应用于药物和饲料领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
中鱼类的基因工程，具体涉及具有抗菌活性哲罗鲑抗菌 肽 HEPCIDIN。
技术介绍
抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs)原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有 抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000~7000Da左右，由20~60个氨基酸残基组成。 这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗 菌肽是1980年由瑞典科学家G. Boman等人经注射阴沟肠杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕 蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins。后来，从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳 动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽，目前已有70多种抗菌多肽的结构被测定。 鱼类作为最早出现免疫球蛋白的动物，其非特异性免疫系统是抵抗各类病原体的 第一道防御屏障。鱼类生活在水中，频繁与大量病原体接触，通过分泌种类繁多的抗菌肽作 为抵抗病原体侵袭的一种非特异性防御途径。当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能迅 速产生抗菌肽以预防和杀伤病原微生物，其合成速度快，在体内扩散迅速、灵活，具有其他 大分子蛋白质（如抗体等）和免疫细胞所不具备的优势。AMPs也被称为宿主防御肽，通常 多分泌在唾液、粘液、循环系统及其他一些病原主要攻击的区域，是非特异性免疫系统的重 要组成部分，通过"溶解性"破坏或"离子"造孔来防御多种细菌、真菌、病毒和其他病原生 物的感染。 哲罗娃，Hucho taimen (pallas)，属娃形目 Samoniformes、娃科 Salmonidea、哲罗 鱼属Hucho,是冷水性的凶猛肉食性鱼类，也是鲑科鱼类中个体最大、生长速度最快的鱼类。 目前哲罗鱼的野生资源基本枯竭，1998年被我国列入中国濒危动物红皮书，属于易危物种， 2004年被列入中国物种红色名录，受到全世界的关注。 随着我国集约化水产养殖的快速发展，各种细菌性和病毒性疾病频繁发生。而防 治过程中大量使用的抗生素及其他药物，不仅破坏了水环境的微生态平衡，更使某些病原 体产生了严重耐药性。因此，加快对主要水产养殖种类免疫防御的基础研究，调动、开发其 自身的防御潜力，是开展健康养殖、实现养殖业可持续发展的重要策略之一。随着水产养殖 动物抗菌肽的分离、结构与功能的研究，改造、合成既具有稳定高效抗菌活性又具有特异抗 菌谱，对宿主无害的抗菌肽基因，通过基因工程在原核细胞、真核细胞或某些藻类中表达， 以实现批量生产，将有希望成为对抗水产养殖对象主要病原体特别是耐药菌的新型药物。
技术实现思路
为了克服上述问题，本研究通过RT-PCR和RACE技术从哲罗鲑中克隆到一种抗菌 肽HEPCIDIN基因，命名为HtH印，并对其结构、同源性、进化、编码蛋白特性及重组蛋白抑菌 活性进行分析。该基因在非特异性免疫防御方面的重要功能，将为哲罗鲑的病害防治、基因 辅助选育及进一步开发为医药产品奠定基础，具有广阔的应用前景。 本专利技术的一个方面提供了一种HtH印，其氨基酸全序列为SEQ ID No. 1。 SEQ ID No. 1 序列为： MKAFSVAVAGVVVLACMFILESTAVPFSEVRKEEVGSIDSPVGEHYQPGSESMRPAEHFRFKRQSHLSL CRWCCNCCHNKGCGFCCKF 具有抗菌活性的成熟肽段氨基酸序列为SEQ ID No. 2 : QSHLSLCRWCCNCCHNKGCGFCCKF SEQ ID No. 2 本专利技术的另一个方面提供了一种编码HtH印的或编码如前所述的HtH印的基因， 其核苷酸序列为SEQ ID No. 3。 SEQ ID No. 3 序列为： ATGAAGGCCTTCAGTGTTGCAGTTGCAGGGGTGGTCGTCCTCGCATGTATGTTCATCCTTGAAAGCACC GCTGTTCCTTTCTCCGAGGTGCGAAAGGAGGAGGTTGGAAGCATTGACAGTCCAGTTGGGGAACATTATCAGCCTGG CAGCGAGTCCATGCGTCCGGCGGAGCATTTCAGGTTCAAGCGTCAGAGCCACCTCTCCCTGTGCCGTTGGTGCTGCA ACTGCTGTCACAACAAGGGCTGTGGCTTCTGCTGCAAATTCTGA 本专利技术的再一个方面提供了一种包含前述基因的表达载体。 本专利技术的再一个方面提供了一种如前所述的HtH印的制备方法，其包括以下步 骤： 步骤1) RT-PCR法获得HtH印基因序列， RT-PCR法所用的引物序列为： Hep-F:5, -ATGAAGGCCTTCAGTGTTGCA-3, SEQ ID No. 4 ; Η印-R:5' -TCAGAATTTGCAGCAGAAGCCACAG-3' SEQ ID No. 5 ; 步骤2) RACE法获得HtH印基因全长cDNA。 RACE法所用的引物序列为： UPM-CTAATACGACTCACTATAGGGC SEQ ID No. 6 ； 5' RACE-GSP1-GGACTCGCTGCCAGGCTGTTGATG SEQ ID No. 7 ; 3' RACE-GSP1-TGCAGCACCAACGGCACAGGGAGA SEQ ID No. 8 ; 步骤3)构建HtHep成熟肽段（简称HtHepmt)重组质粒pET32a(+)_HtHepmt ; 构建pMD18T_hep质粒，以pMD18T_hep质粒为模板，以Hepmt-F/Hepmt-R为引物进 行HtH印mt片段的PCR扩增，将扩增产物构建重组pMD18T-Ht!fepmt载体，酶切后将HtH印mt 片段与pET32a(+)载体连接， Hepmt-F/Hepmt-R 引物序列分别为： Hepmt-F:5, -GAATTCATGCAGAGCCACC-3? SEQ ID No. 9 ； Η印mt-R:5, -GTCGACTCAATGATGATGATGATGATGGAATTTGCAG-3, SEQ ID No. 10 ; 步骤 4)pET32a(+)_HtHepmt 重组质粒转化表达菌株 E. coli Rossetta(DE3)感受 态细胞； 步骤5) HtHepmt重组蛋白的诱导表达。 本专利技术的再一个方面提供了一种以前述制备方法制备获得的HtH印，所述HtH印 具有25个氨基酸的成熟肽，含有8个保守结构Cys残基，成熟肽分子式为C11SH17具80 31Ss，分 子量为2. 88kDa，理论等电点为8. 53。 本专利技术的再一个方面提供了一种如前所述的HtHep在制备治疗抑菌药物中的用 途，优选地，所述抑菌指抑制溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌或大肠杆菌活性。 本专利技术的再一个方面提供了一种如前所述的HtHep在制备具有病害防治功能的 水生生物或养殖畜禽饲料中的用途。【附图说明】 图1为基于NJ法构建的不同生物抗菌肽HEPCIDIN基因序列的系统进化树。 图2为HtHep基因序列及其翻译的氨基酸序列分析。注：起始密码子ATG和终止 密码子TGA用斜体标明，终止子TGA用*号表不。 图3为HtH印信号肽预测。 图4为Htifep氨基酸序列比对结果。注表示8个保守的Cys残本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN，其氨基酸全序列为SEQ ID No.1，优选地，哲罗鲑抗菌肽HEPCIDIN成熟肽氨基酸序列为SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王荻，李绍戊，赵景壮，刘红柏，卢彤岩，匡友谊，尹家胜，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
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