血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法技术

本申请涉及一种血叶兰种子组织培养快速育苗方法，步骤包括：1.选择培养材料；2.原始球茎的诱导培养；3.原始球茎的增殖培养；4.分化与壮苗培养。该发明专利技术其解决了血叶兰在自然状态下难萌发以及果实发育周期短导致种子成熟度不一致、种子寿命短和大量败育的问题，开发一种可快速繁殖血叶兰种苗的方法。该方法取材方便且成功率高，可用于挽救种子发育不一致的血叶兰果实，生产大量的血叶兰种苗，更好地保护血叶兰资源。

【技术实现步骤摘要】
血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法
本申请涉及一种血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法，应用在保护血叶兰资源和生产血叶兰种苗上。
技术介绍
血叶兰Ludisiadiscolor(Ker-Gaw1.)A.Rich.是兰科血叶兰属植物，全属有4种，我国仅有1种，即血叶兰。其分布于海拔900-1300米山坡或沟谷常绿阔叶林下阴湿处，根茎呈匍匐状，形似蚕，茎节生根，叶呈紫黑色，上有细小的绒毛，有金红色或银白色脉纹，似丝绒状，十分美丽，具有较高的观赏价值。同时它又是民间传统的中草药，全草入药，有滋阴润肺、清热凉血之功效，能治疗肺结核咯血、神经衰弱、食欲不振等症，疗效甚佳。由于血叶兰兼具观赏和药用价值，具有很好的市场开发潜力。随着人们过度采挖以及生态环境被破坏，血叶兰野生资源越来越稀少，属珍稀的物种之一，已有濒临灭绝的危险。目前，血叶兰种苗的繁殖方法有分株繁殖和扦插繁殖，繁殖速度慢，难以满足规模化种植需求，因此，急需应用植物组织培养方法进行血叶兰种苗的快速繁殖。有关血叶兰组织培养方法已有报道，一种方法是以茎段和顶芽作为外植体，通过诱导产生类原始球茎、类原始球茎增殖、类原始球茎分化及壮苗和生根培养的途径来繁殖试管苗，该方法通过诱导茎段或顶芽组织产生类原始球茎，其分化率不详，类原始球茎的增殖倍数为4.86，88.6％的类原始球茎可分化成不定芽；另一种是采用八九分成熟的蒴果进行种子的无菌繁殖，但该方法未见详细的培养途径的报道。血叶兰是兰科植物，其种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发，而且血叶兰的果实与其他兰科植物的果实发育周期不同，血叶兰的果实发育周期短、同个果实中的种子成熟度不一致，导致了种子寿命短和大量败育，因此，急需研究开发利用血叶兰种子的组培快速育苗方法，为进行人工栽培保护血叶兰资源提供种苗。
技术实现思路
本申请提供一种血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法，解决了血叶兰在自然状态下难萌发以及果实发育周期短导致种子成熟度不一致、种子寿命短和大量败育的问题，开发一种可快速繁殖血叶兰种苗的方法。该方法取材方便且成功率高，可用于挽救种子发育不一致的血叶兰果实，生产大量的血叶兰种苗，更好地保护血叶兰资源。本申请申请技术方案如下：一种血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法，其特征在于：其步骤包括，1)选择培养材料：于血叶兰开花期，选择生长健壮的优良株系进行同株或异株授粉，授粉25-40天后，摘取果实外表颜色为白色或淡黄色且未开裂的果实作为培养材料用于组织培养；或者用野外采集到的野生血叶兰植株上的果实外表颜色为白色或近黄色且未破裂的蒴果用于组织培养；2)原始球茎的诱导培养：包含以下步骤①消毒处理：将步骤1)中选取的果实先用质量百分比浓度为80-95％的酒精浸泡30-50s后，用无菌水冲洗干净，接着进行二次消毒；所述二次消毒是将果实先倒入质量百分比浓度为0.01-0.02％的吐温20溶液中，摇晃10-20s后，夹出果实，置于质量百分比浓度为10-15％次氯酸钠溶液中消毒8-12min，或者将果实置于吐温20和次氯酸钠的混合溶液中消毒8-12min并用无菌水冲洗干净，所述吐温20和次氯酸钠的混合溶液中，吐温20的质量百分比浓度为0.01-0.02％，次氯酸钠的质量百分比浓度为10-15％；②萌发培养处理：将步骤①消毒处理过的果实用无菌水冲洗干净后用无菌解剖工具剖开果实，取出白色浆状或粉状种胚接种到胚萌发培养基上，将接种后的培养瓶置于温度20-28℃的培养室内进行无光照培养20-30天，诱导种胚萌发成原始球茎，再转入温度20-25℃、光照强度为1600-2200lx的条件下培养15-30天以强壮原始球茎，同时诱导种胚继续萌发原始球茎；所述的胚萌发培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+土豆泥20-50g/L+椰子水30-80ml/L+脯氨酸5-10mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.0-5.4；3)原始球茎的增殖培养：将上述步骤2)中获得萌发的原始球茎转入原始球茎增殖培养基中进行增殖培养，在培养温度20-25℃，光照强度1500-2000lx，光照时间8-12h/天的条件下，培养30-60天以诱导原始球茎的增殖；所述的增殖培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+6-BA或6-糠氨基嘌呤KT0.5-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+椰子水30-60ml/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶4.5-5.5g/L，pH值为5.0-5.4；4)分化与壮苗培养：将上述步骤3)中获得的原始球茎转入分化与壮苗培养基中，培养温度20-28℃，光照强度2000-2500lx，光照时间8-12h/天，培养60-90天，使得原始球茎分化形成健壮的具根、茎、叶的完整血叶兰植株；所述的分化与壮苗培养基由以下组分配置而成：1/2MS基本培养基+NAA0.2-0.5mg/L+香蕉泥50-80g/L+白糖20-40g/L+活性炭0.5-3.0g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.2-5.6。该血叶兰种子的组织培养快速育苗方法采用了与现有血叶兰组培育苗方法不同的是外植体和培养途径。而现有血叶兰的组织培养方法，多选用茎段或顶芽为外植体，诱导产生类原始球茎；或者采用八九分成熟的蒴果进行种子的无菌繁殖，但培养途径不详。本申请的血叶兰种子的组织培养快速育苗方法不仅取材方便，而且经分化与壮苗培养步骤，能诱导约94％的原始球茎分化形成健壮的血叶兰幼苗完整植株，对血叶兰的资源保护意义重大。步骤2)的第①步消毒处理是将步骤1)中选取的果实先用质量百分比浓度为80％的酒精浸泡35s后，用无菌水冲洗干净，接着进行二次消毒；所述二次消毒是将果实先倒入质量百分比浓度为0.01％的吐温20溶液中，摇晃15s后，夹出果实，置于质量百分比浓度为10％次氯酸钠溶液中消毒10min，或者将果实置于吐温20和次氯酸钠混合溶液中消毒10min，所述吐温20和次氯酸钠混合溶液中，吐温20的质量百分比浓度为0.01％，次氯酸钠的质量百分比浓度为10％。经上述消毒步骤后，其组织培养的染菌率明显降低。步骤2)中的胚萌发培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+土豆泥50g/L+椰子水30ml/L+脯氨酸8mg/L+蔗糖20g/L+琼脂或卡拉胶5.8g/L，pH值为5.4。使用上述胚萌发培养基可以提高原始球茎的诱导萌发率。步骤2)中接种后置于无光照条件下以诱导种胚萌发成原始球茎的培养天数为25天，强壮原始球茎使用的光照强度为1800lx，培养天数为20天。这样可以提高原始球茎的诱导萌发率。步骤3)中增殖培养以诱导原始球茎增殖的培养温度为22±2℃，光照强度为1800lx，光照时间为10h/天，培养天数为50天。这样可以更好地促进原始球茎的增殖。步骤3)中所述的增殖培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+6-BA或6-糠氨基嘌呤KT0.8mg/L+NAA0.3mg/L+椰子水50ml/L+白糖30g/L+琼脂或卡拉胶4.5g/L，pH值为5.4。使用上述原始球茎增殖培养基可以促进原始球茎的增殖。步骤4)中原始球茎转入分化与壮苗培养基中诱导原始球茎分化形成健壮的完整植株，培养温度为20-28℃，光照强度为2500lx，光照时间为8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法，其特征在于：其步骤包括，1)选择培养材料：于血叶兰开花期，选择生长健壮的优良株系进行同株或异株授粉，授粉25‑40天后，摘取果实外表颜色为白色或淡黄色且未开裂的果实作为培养材料用于组织培养；或者用野外采集到的野生血叶兰植株上的果实外表颜色为白色或近黄色且未破裂的蒴果用于组织培养；2)原始球茎的诱导培养：包含以下步骤①消毒处理：将步骤1中选取的果实先用质量百分比浓度为80‑95％的酒精浸泡30‑50s后，用无菌水冲洗干净，接着进行二次消毒；所述二次消毒是将果实先倒入质量百分比浓度为0.01‑0.02％的吐温20溶液中，摇晃10‑20s后，夹出果实，置于质量百分比浓度为10‑15％次氯酸钠溶液中消毒8‑12min，或者将果实置于吐温20和次氯酸钠的混合溶液中消毒8‑12min并用无菌水冲洗干净，所述吐温20和次氯酸钠的混合溶液中，吐温20的质量百分比浓度为0.01‑0.02％，次氯酸钠的质量百分比浓度为10‑15％；②萌发培养处理：将步骤①消毒处理过的果实用无菌水冲洗干净后用无菌解剖工具剖开果实，取出白色浆状或粉状种胚接种到胚萌发培养基上，将接种后的培养瓶置于温度20‑28℃的培养室内进行无光照培养20‑30天，诱导种胚萌发成原始球茎，再转入温度20‑25℃、光照强度为1600‑2200lx的条件下培养15‑30天以强壮原始球茎，同时诱导种胚继续萌发原始球茎；所述的胚萌发培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+土豆泥20‑50g/L+椰子水30‑80ml/L+脯氨酸5‑10mg/L+蔗糖20‑30g/L+琼脂或卡拉胶5.0‑8.0g/L，pH值为5.0‑5.4；3)原始球茎的增殖培养：将上述步骤2中获得萌发的原始球茎转入原始球茎增殖培养基中进行增殖培养，在培养温度20‑25℃，光照强度1500‑2000lx，光照时间8‑12h/天的条件下，培养30‑60天以诱导原始球茎的增殖；所述的增殖培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+6‑BA或6‑糠氨基嘌呤KT 0.5‑2.0mg/L+NAA 0.2‑0.5mg/L+椰子水30‑60ml/L+白糖20‑30g/L+琼脂或卡拉胶4.5‑5.5g/L，pH值为5.0‑5.4；4)分化与壮苗培养：将上述步骤3中获得的原始球茎转入分化与壮苗培养基中，培养温度20‑28℃，光照强度2000‑2500lx，光照时间8‑12h/天，培养60‑90天，使得原始球茎分化形成健壮的具根、茎、叶的完整血叶兰植株；所述的分化与壮苗培养基由以下组分配置而成：1/2MS基本培养基+NAA 0.2‑0.5mg/L+香蕉泥50‑80g/L+白糖20‑40g/L+活性炭0.5‑3.0g/L+琼脂或卡拉胶5.0‑8.0g/L，pH值为5.2‑5.6。...

【技术特征摘要】
1.一种血叶兰种子的组织培养与快速育苗方法，其特征在于：其步骤包括，1)选择培养材料：于血叶兰开花期，选择生长健壮的优良株系进行同株或异株授粉，授粉25-40天后，摘取果实外表颜色为白色或淡黄色且未开裂的果实作为培养材料用于组织培养；或者用野外采集到的野生血叶兰植株上的果实外表颜色为白色或近黄色且未破裂的蒴果用于组织培养；2)原始球茎的诱导培养：包含以下步骤①消毒处理：将步骤1)中选取的果实先用质量百分比浓度为80-95％的酒精浸泡30-50s后，用无菌水冲洗干净，接着进行二次消毒；所述二次消毒是将果实先倒入质量百分比浓度为0.01-0.02％的吐温20溶液中，摇晃10-20s后，夹出果实，置于质量百分比浓度为10-15％次氯酸钠溶液中消毒8-12min，或者将果实置于吐温20和次氯酸钠的混合溶液中消毒8-12min并用无菌水冲洗干净，所述吐温20和次氯酸钠的混合溶液中，吐温20的质量百分比浓度为0.01-0.02％，次氯酸钠的质量百分比浓度为10-15％；②萌发培养处理：将步骤①消毒处理过的果实用无菌水冲洗干净后用无菌解剖工具剖开果实，取出白色浆状或粉状种胚接种到胚萌发培养基上，将接种后的培养瓶置于温度20-28℃的培养室内进行无光照培养20-30天，诱导种胚萌发成原始球茎，再转入温度20-25℃、光照强度为1600-2200lx的条件下培养15-30天以强壮原始球茎，同时诱导种胚继续萌发原始球茎；所述的胚萌发培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+土豆泥20-50g/L+椰子水30-80ml/L+脯氨酸5-10mg/L+蔗糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶5.0-8.0g/L，pH值为5.0-5.4；3)原始球茎的增殖培养：将上述步骤2)中获得萌发的原始球茎转入原始球茎增殖培养基中进行增殖培养，在培养温度20-25℃，光照强度1500-2000lx，光照时间8-12h/天的条件下，培养30-60天以诱导原始球茎的增殖；所述的增殖培养基由以下组分配置而成：MS基本培养基+6-BA或6-糠氨基嘌呤KT0.5-2.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L+椰子水30-60ml/L+白糖20-30g/L+琼脂或卡拉胶4.5-5.5g/L，pH值为5.0-5.4；4)分化与壮苗培养：将上述步骤3)中获得的原始球茎转入分化与壮苗培养基中，培养温度20-28℃，光照强度2000-2500lx，光照时间8-12h/天，培养60-90天，使得原始球茎分化形成健壮的具根、茎、叶的完整血叶兰植株；所述的分化与壮苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈菁瑛，刘保财，
申请(专利权)人：福建省农业科学院农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35