一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，属分子标记技术领域。该方法将待鉴定样品PCR反应获得扩增产物测序后，与碧螺春母树品种条形码比对，当扩增产物的SNP序列与碧螺春适制品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。本发明专利技术克服了用感官审评或理化分析等方法难以鉴别碧螺春茶的真伪以及山茶属下不同茶树品种的技术问题，能有效、简便快速地对碧螺春商品茶的品种进行准确鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子标记
，具体涉及。
技术介绍
茶树是一种重要的经济作物，是21世纪最流 行的健康饮料植物之一。中国是茶树的原产地，产茶历史悠久。近年来，中国茶产业快速 发展，产业规模不断扩大，茶园种植面积、产量、出口数量和金额屡创新高。同时，二十世纪 九十年代开始全国各地挖掘、恢复历史名茶和创制新名茶并举，名优茶数量不断增加，质量 逐年提高，市场全面开拓。苏州洞庭碧螺春茶作为全国著名历史名优茶之一，碧螺春茶产于 苏州太湖洞庭，该地气候湿润温和、常年云雾弥漫，良好的生态环境、适宜的茶树品种和精 细的加工工艺，成就了碧螺春茶的独特品质，其外形条索纤细、色绿隐翠、茸毫披覆、卷曲似 螺、内质汤色嫩绿、香气鲜雅、兰韵突出，滋味鲜醇、回味绵长，叶底柔嫩，因此以形美、色艳、 香浓、味醇"四绝"以及悠久的帝王传说享誉海内外。2002年12月，洞庭碧螺春茶列为国家 原产地保护产品（GB18957-2003)。目前，苏州"洞庭碧螺春"茶的茶树群体种以小、中叶型灌木为主。根据苏州市吴 中区农林局林业站统计：目前东西山共有28000余亩茶园，其中洞庭地方群体茶树品种茶 园18000多亩，年产茶叶276吨，其中碧螺春128吨，茶叶总产值15000万元左右，其中碧螺 春产值12500万元左右。洞庭山茶树通常称为东、西山群体中小叶型，嫩梢较长，重量较轻。 东、西山群体种以"柳叶条"、"酱板头"、"柴茶"等小叶茶树品种为代表，这些茶树品种适宜 制作洞庭碧螺春，是目前洞庭碧螺春原产地主导茶树品种。目前，碧螺春茶因其在茶叶市场中价值高、功效多的特性而不可避免地遭到了仿 冒，因此有必要对名优茶的品质真伪进行鉴别，以保护品茶爱好者的利益，维持名优茶市场 的公平公正性。感官判别和理化检测是最常用的茶叶品质鉴别方法，但感官的判别方法受 品茶师的个人经验、心理和生理因素等影响，往往判别结果的准确性和重复性差；理化检测 的方法只限于某些茶叶内部特定组分的分析，而且分析流程多，成本高。 近年来，分子生物学和生物技术迅速发展，遗传标记技术在此基础上也得到了迅 猛发展。分子标记作为继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后一种新的遗传标记技术， 发展时间虽短但具有广阔的应用前景和巨大的应用潜力，在遗传图谱构建、群体遗传结构 和多样性分析、物质演化和亲缘关系研究中具有重要意义。目前，分子标记技术已在茶树 研究中广泛应用，取得较多进展，并且研究也不断改进。在茶树中应用较多的分子标记技 术为限制性内切酶片段长度多态性（RFLP)、随机扩增多态性DNA标记（RAPD)、简单序列重 复（SSR)、扩增片段长度多态性（AFLP)、单核苷酸多态性（SNP)等。虽然RFLP、RAPD、SSR、 AFLP在分子标记技术中具有各自的优点，但是也存在实验操作繁琐、检测周期长、成本高等 缺点。单核苷酸多态性（SNP)作为最常见的一种可遗传变异，广泛存在动植物基因组中。 SNPs是指基因组水平上，单个核苷酸变异形成的DNA序列多态性，为第三代分子标记的代 表。SNP包括两种形式，碱基的转换或碱基的颠换，具有分布广泛、数量巨大、遗传稳定性强， 基因编码区的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平等优点，而且也易于 自动快速检测和自动化分析，是研究复杂遗传性状和基因组进化的理想标记。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供。本专利技术利用 分子标记技术克服了感官判别和理化检测方法的不足，利用SNP差异位点，最终达到碧螺 春茶品质真伪快速鉴别的目的检测。 技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种碧螺春商品茶的分子鉴定 方法，包括以下步骤： 1)确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个 基因序列； 2)引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物， 并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物； 3)基因组DNA提取； 4)PCR扩增及检测； 5)将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱 基序列如SEQIDN0 :25~30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差 异碱基序列的相似性达到99. 5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。 其中，上述引物的设计长度18-25bp，产物大小为200-600bp，Tm值为50°C-60°C， GC含量在40% -60 %之间。 其中，上述基因组DNA提取采用改良CTAB法从新鲜叶片中提取基因组DNA，其主要 操作步骤为： 1)将0.lg的茶叶放入研钵中，并加入少量的PVPP，倒入液氮，将叶片充分研磨至 白色粉末状，并转移至1. 5mL离心管，然后在离心管中加入0. 6mL预热的CTAB提取液并充 分震荡混匀，65°C水浴一小时，期间不断震荡混匀； 2)在离心管中加入等体积的氯仿异戊醇混合液，充分混匀，室温静置5min; 3)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心lOmin，吸上清液至新离心管，加入等体积的 氯仿异戊醇混合液，混匀后静置5min; 4)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心10min，吸上清液至新离心管，加入等体积的 异丙醇混匀后在_20°C下放置lh以上； 5)使用离心机在4°C下5000rpm离心5min，弃上清液收集沉淀； 6)在离心管中加入高盐缓冲液，在65°C水浴，溶解沉淀； 7)使用离心机在4°C下lOOOOrpm离心5min，吸上清液于新离心管； 8)在管中加入1/10体积NaAc及2/3体积异丙醇，混匀，在-20°C放20min; 9)使用离心机在4°C下5000rpm离心5min，弃上清液，收集沉淀； 10)使用70 %的乙醇洗涤沉淀3次，倒置离心管于吸水纸上，干燥沉淀； 11)使用300yL超纯水溶解沉淀，加入0. 5RNase使RNA降解； 12)使用NanoDropND-1000分光光度计测定浓度和纯度； 13)使用1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。 其中，上述PCR扩增反应程序为：94°C预变性lOmin;然后进入循环，每个循环 94°C变性30sec，52~55°C退火30sec，72°C延伸90sec，共35个热循环，最后延伸72°C延 伸lOmin;4°C冷却后取出扩增产物。 有益效果：本专利技术能够节省成本，以及对于样本量没有限制，克服了直接使用单个 位点进行确认不太准确的问题，本专利技术通过采用6个SNP位点确定更加准确。该方法简单 易行，稳定可靠，只需极少量样品就可完成，具有很好的实用价值，碧螺春正品，可以用其他 相似茶叶作为代用品，本专利技术方法能方便地鉴定出碧螺春、能方便地将碧螺春与从形态特 征易与碧螺春混淆的其它茶叶区别开。因此，本专利技术方法对保护碧螺春的收购及茶叶生产 质量具有十分重要的应用价值。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发 明进一步详细说明。 实施例1: 1、材料的选取以及6个SNP位点的确定 碧螺春茶叶样品为不同省份碧螺春样品。试验中，碧螺春茶样分别于2013年5-6 月购自江苏、浙江、安徽和福建等产茶名区。碧螺春的6个SNP位点的基因序列参见S本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种碧螺春商品茶的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1）确定碧螺春茶叶样品的6个SNP位点，在NCBI中通过blast找到的对应的6个基因序列；2）引物的设计；根据找到的6个基因序列，按照同源克隆的方法，找到近缘植物，并进行序列的比对，找到同源性较高的片段区域，设计这6个基因片段的上下游引物；3）基因组DNA提取；4）PCR扩增及检测；5）将扩增产物测序后与碧螺春母树品种条形码比对，碧螺春母树品种条形码的碱基序列如SEQ ID NO ：25~30所示，扩增产物的SNP序列与碧螺春母树品种条形码所示的差异碱基序列的相似性达到99.5%以上，则该待鉴定样品为碧螺春品种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：房婉萍，李庆会，周琳，徐亚婷，徐辉，李磊，叶睿翔，朱旭君，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京菀园农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32