维生素D的新应用制造技术

本发明专利技术涉及一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，通过每次传代以及每次更换培养基后添加活性维生素D(1,25(OH)2D3)，以达到减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的目的；本发明专利技术还提供维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，通过长期使用低剂量的维生素D、25–羟维生素D或活性维生素D，可以有效减弱卵巢表面上皮细胞在裸鼠体内的致瘤能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及维生素D的新应用。
技术介绍
中国癌症协会2015年2月15日发布的新数据表明，仅2011年，中国卵巢癌发 病人数与死亡人数分别为45, 223和18, 430人。卵巢表面上皮细胞（OvarianSurface EpithelialCell，OSEC)是包被在卵巢表面的一层立方-长方形细胞，位于卵巢韧带和腹 膜间皮之间，起源于苗勒氏系统。在卵巢排卵后，起到修复卵巢表面破溃的作用。 按照起源，卵巢癌主要分为三种：1上皮-间质性；2性索-间质性；3生殖细胞肿 瘤。目前研究认为，上皮性肿瘤约占所有卵巢肿瘤的60%，其中大约90%的恶性卵巢肿瘤 被认为起源于正常的卵巢表面上皮（OvarianSurfaceEpithelia0SE)细胞。卵巢表面上 皮的恶性转化的原因基本可以分为三类，炎症因子的刺激、持续的促性腺激素刺激和持续 不断的排卵。如果卵巢表面上皮细胞覆盖在一个不排卵的卵巢上面时它就会处在一个静止 的间质状态，而同时具有上皮细胞与间质细胞的特点。当卵巢连续性排卵或者组织重建时， OSE就会发生一个去分化的过程，从上皮细胞向间质细胞转化（EMT)。此过程首次被发现是 在胚胎发生时，并被认为是胚胎形成的关键。后来研究发现EMT过程与成人器官纤维化及 肿瘤转移有关。有研究证明，EMT参与了卵巢癌发生过程中肿瘤细胞生长、生存、迀移、侵袭 及耐药性的调节，并被认为是卵巢癌发展的一个关键性过程。 卵巢癌是一种病死率极高的妇科癌症，这主要与其三个特性有关：一是卵巢癌早 期缺少有效的筛查与诊断措施；二是卵巢癌恶性程度高，晚期易发生转移；三是卵巢癌晚 期，癌细胞对卡铂和紫杉醇等化疗药物易产生耐药性。卵巢癌极易发生远端转移，早期筛查 及诊断率低，而且在晚期对放疗和化疗易产生耐受性，病死率极高，因此，对于卵巢癌的预 防性治疗药物的发现迫在眉睫。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种有效减缓卵巢表面上皮恶性转化 进程的方法，特别是维生素D在卵巢癌的预防性治疗药物上的新应用。 本专利技术第一方面涉及一种小鼠卵巢表面上皮细胞（MouseOvarianSurface EpithelialCell，M0SEC)体外恶性转化培养方法，包括以下步骤： 1)卵巢表面上皮细胞分离：取6-8周龄未生育过的健康雌性C57BL/6小鼠的卵 巢，冲洗并剥离残留的输卵管、脂肪组织及卵巢被膜后，利用胰酶消化分离其卵巢表面上皮 细胞，然后加入完全培养基以终止胰酶消化过程，离心弃上清液后再次加入选择性完全培 养基并移入培养皿中在培养箱中孵育，孵育第2天避免移动培养皿，孵育第3天根据细胞生 长情况采用半量换液法更换培养液，当卵巢表面上皮细胞密度达80%时，使用免疫荧光法 检测上皮细胞标志物角化蛋白（Pan-keratin)的表达，当其阳性率达95%以上且鹳卵石样 立方上皮细胞达80-85%以上时，进行下一步骤； 2)早期传代：接种代数小于15代的卵巢表面上皮细胞，使用半量换液法按2 :3至 3 :2比例传代，传代时间间隔5-7天，培养液采用选择性完全培养基； 3)中期传代：接种代数在16至84代之间的卵巢表面上皮细胞，16-60代按1 :2至 1:4比例传代，60代后按1 :5至1 :8比例传代，传代时间间隔为3-5天，培养液采用完全培 养基； 4)晚期传代：接种代数大于85的卵巢表面上皮细胞，按1 :8至1 :10比例传代，传 代时间间隔为3-5天，培养液采用部分性完全培养基。 所述选择性完全培养基、完全培养基均为包括胎牛血清（FBS)、mEGF、以及胰岛 素-转铁蛋白-亚硒酸钠（Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12培养液，所述部 分性完全培养基为包括胎牛血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠且不含mEGF的DMEM/F12 培养液；所述选择性完全培养基、完全培养基、部分性完全培养基中胎牛血清的浓度依次增 大，所述选择性完全培养基中mEGF的浓度高于完全培养基中mEGF的浓度。 进一步的，接种代数在15代之前的卵巢表面上皮细胞，每次传代时使用胰酶溶液 的消化时间为30-45s，所述胰酶溶液中胰酶浓度为0. 1 %且不含EDTA。 进一步的，所述选择性完全培养基为包括3-4%胎牛血清（FBS)U-L2%青霉 素-链霉素（Penicillin-Streptomycin)、8_10ng/mlmEGF、1-1. 2%膜岛素-转铁蛋白-亚 硒酸钠（Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培养液。 进一步的，所述完全培养基为包括6-8 %胎牛血清（FBS)U-L2 %青霉素-链霉 素（Penicillin-Streptomycin)、2_4ng/mlmEGF、1-1. 2 %膜岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠 (Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培养液。 进一步的，所述部分性完全培养基为包括8-10 %胎牛血清（FBS)U-L2 %青 霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin)、1-1. 2 %胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠 (Insulin-Transferrin-Selenium)的DMEM/F12 培养液。 进一步的，所述卵巢表面上皮细胞分离步骤完成后，进行免疫荧光鉴定和/或免 疫组化鉴定之后，当鉴定结果符合标准后进行早期传代步骤。 本专利技术第二方面涉及一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，采用前述的卵 巢表面上皮细胞体外恶性转化方法、或采用其它能够使卵巢表面上皮细胞在体外恶性转化 方法，以建立卵巢表面上皮细胞恶性转化模型；培养过程中，在卵巢表面上皮细胞每次传代 及每次更换培养基时添加活性维生素D(1，25(0H)2D3);应当说明的是：所述减缓是指对卵 巢表面上皮细胞由正常到恶性转化全过程中细胞恶性程度进展的减缓；此外，体外培养细 胞与体内实验不同，只能通过添加活性维生素D以提高活性维生素D的终浓度，而人或动物 体内由于含有维生素D代谢酶或合成代谢的完成系统，可以通过添加维生素D、25 -羟维生 素D(25 (OH)D)或活性维生素D(1，25 (OH) 2D3)以提高活性维生素D的终浓度。 优选的，减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，所使用的培养基中添加活性维 生素D(1，25 (OH) 2D3)、并使其终浓度维持在0. 5~3nM;在小鼠卵巢上皮细胞恶性转化的三 个阶段中，由于细胞性质的变化使得维生素D的代谢酶和维生素D受体的表达出现差异，在 添加活性维生素D之后，其浓度值会在0. 5-3nM之间波动。优选的，活性维生素D或代谢后 的活性维生素D的终浓度维持在1 ±0. 5nM。 优选的，培养过程中，在避光条件下添加活性维生素D。 优选的，培养过程中，在低温环境下添加活性维生素D，优选为-30~_20°C的环境 下，例如在冰箱里完成活性维生素D添加过程后立即放入37°C培养箱，或是添加时才从冰 箱中将活性维生素D取出。 本专利技术第三方面涉及维生素D在制备减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的试剂上 的应用，所述维生素D为包括维生素D2 (麦角钙化醇，VD2)、维生素D3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，其特征在于：卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，每次传代及每次更换培养基时添加活性维生素D。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李冰燕，王萍，张鹤美，张增利，刘利芝，侯永凤，胡志勇，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32