优化的Fc片段及其优化方法和应用技术

本发明专利技术提供了优化的Fc片段及其优化方法和应用。优化的Fc片段，是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。优化方法，包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。还包括表达与纯化步骤。本发明专利技术用于含有Fc片段的改造的应用。本发明专利技术提供的Fcs骨架，稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。本发明专利技术提供的优化的Fc片段骨架可应用于完整的IgG或者相关的Fc融合蛋白以及用于进一步研究给相关生物制剂的血浆半衰期的带来的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药工程
，尤其涉及优化的Fc片段及其优化方法和应用。
技术介绍
抗体以其特异性强、灵敏度高，广泛应用于各个领域，尤其是生命科学研究和临床治疗如ELISA、Westernblot、免疫荧光分析、疾病快速诊断以及作为生物制剂治疗各种疾病。因此，进入21世纪以来，人们也开始越来越关注治疗性抗体药物的研发与临床应用，这是因为它对人体毒副作用小、具有天然和高度特异性的疗效，并且创造出了巨大的社会效益和经济效益。同时，基于Fc片段的融合蛋白不仅以其分子量相对较小而具有很好的组织渗透性，而且偶联的Fc片段可与Fc受体(FcRn)等效应分子相互作用，因而延长了药物的血浆半衰期以及可诱导ADCC、CDC效应或者吞噬作用。然而，这些抗体药物以及Fc融合蛋白作为生物活性大分子，它也有自身的局限性，如稳定性差、抗聚集能力弱，在其表达、纯化、贮存等过程中，会倾向于聚集或者降解。而蛋白聚集所导致的免疫原性，不仅降低了药效，同时也给临床应用带来很大的风险。因此，提高抗体热稳定性与抗聚集能力是该领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
针对现有技术的上述缺陷和问题，本专利技术的目的是提供优化的Fc片段及其优化方法和应用。解决了现有Fc片段的热稳定性和抗聚集能力差的技术问题。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：优化的Fc片段，是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。<br>本专利技术中涉及的Fc片段可以采用不同物种的免疫球蛋白的Fc片段，具体地，如哺乳动物等，更具体地，如人类。优化方法，包括利用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，野生型Fc的扩增方法为：人源血样抽提细胞总RNA，逆转录得到cDNA；以cDNA为模板进行PCR反应，得到野生型Fc基因片段；PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。进一步地，所述扩增步骤中，以人源血样为例，优化的Fc片段的扩增方法为：以野生型Fc基因片段为模板进行PCR反应，得到优化的Fc片段；其中，PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。进一步优选的技术方案为，在扩增步骤完成后，还包括表达与纯化步骤；所述表达与纯化步骤具体为：将SfiI酶切后的优化Fc片段与原核表达载体进行连接、转化相应的表达宿主菌得到优化Fc菌株；再对优化Fc菌株进行原核表达，纯化得到优化Fc片段的目的蛋白。具体地，所述原核表达载体采用表达载体pCom，相应的表达宿主菌采用大肠杆菌HB2151。或者其它原核表达载体和相应的表达宿主菌。进一步地，在表达与纯化步骤中，首先采用琼脂糖凝胶电泳回收优化Fc片段，然后用SfiI酶切优化Fc片段，再胶回收，得到SfiI酶切后的优化Fc片段。进一步地，在表达与纯化步骤中，原核表达具体操作如下：将优化Fc菌株接种到10mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养3～4小时；随后，按2％接种量接种到500mlSB培养基，于37℃、250rpm摇床培养至OD600达到0.6时，加入250μl浓度为200μg/mlIPTG于37℃诱导表达过夜。具体地，所述SB培养基的组成为：1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10gMOPS，pH值用5MNaOH调至7.0。进一步地，在表达与纯化步骤中，纯化具体操作如下：经原核表达后，第一次离心收集菌体，用50mlPBS重悬，加入250μl多粘菌素B室温处理30min，再次离心收集上清；将收集的上清过滤后，用Ni-NTA填料纯化优化的Fc蛋白；将镍柱洗脱后的优化的Fc蛋白稀释到50ml，进一步用ProteinG填料分别纯化优化的Fc蛋白，随后用截留分子量为10kD的超滤离心管超滤浓缩优化的Fc目的蛋白；其中，第一次离心的参数为：8000g，4℃，15min；再次离心的参数为：10000g，4℃，15min。本专利技术的优化的Fc用于含有Fc片段的改造的应用。进一步地，本专利技术的优化的Fc用于全长单克隆抗体、抗体片段与Fc的融合蛋白、生物活性蛋白与Fc的融合蛋白、生物活性化合物与Fc的偶联产物等的含有Fc片段的改造的应用。本专利技术以Fc为骨架，对其进行定向修饰改造，最终得到稳定性与抗聚集性得到提高的新的Fc克隆。本专利技术提供的优化的Fc片段骨架可应用于完整的IgG或者相关的Fc融合蛋白以及用于进一步研究给相关生物制剂的血浆半衰期的带来的影响。本专利技术通过CD、分子筛、荧光检测仪、紫外分光光度计、ELISA等方法对优化的Fc片段的二级结构、存在形式、稳定性、抗聚集性进行了鉴定，用野生型Fc进行对照。ELISA实验也证明Fcs能够与Fc受体(FcRn)相结合，因此，修饰改造后的Fcs提高了自身稳定性的同时并没有破坏自身生物学效应。本专利技术提供的Fcs骨架，其优点在于：首先，相对于野生型的Fc，其稳定性更好，可降低单克隆抗体或者Fc融合蛋白的生产、纯化、保存成本；其次，相对于野生型的Fcs，其抗聚集能力更好，可降低因为蛋白的聚集而导致临床使用风险。本专利技术中，制备优化Fc的方法不仅限于对SeqIDNo.3序列中的Fc的改造，也包括对其它各类抗体分子的Fc片段的改造，比如，对不同类型的免疫球蛋白，来源于不同物种的免疫球蛋白的改造。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是现有Fc片段的结构示意图；图2是本专利技术的优化方法中Fc、Fcs蛋白的蛋白免疫印迹检测结果图；图3是本专利技术的优化方法中纯化后的Fc、Fcs蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图4是本专利技术的Fcs和Fc的AKTA分析结果曲线图；图5是本专利技术的F本文档来自技高网...

【技术保护点】
优化的Fc片段，其特征在于：是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的7个氨基酸截除得到的。

【技术特征摘要】
1.优化的Fc片段，其特征在于：是通过将Fc片段的N端的不规则卷曲的
7个氨基酸截除得到的。
2.如权利要求1所述的优化的Fc片段的优化方法，其特征在于：包括利
用RT-PCR，从血样中扩增出野生型Fc，再设计引物将野生型Fc的N端的7个
氨基酸进行截断，扩增出优化Fc片段的扩增步骤。
3.根据权利要求2所述的优化方法，其特征在于：所述扩增步骤中，以人
源血样为例，野生型Fc的扩增方法为：人源血样抽提细胞总RNA，逆转录得到
cDNA；以cDNA为模板进行PCR反应，得到野生型Fc基因片段；PCR反应中采用
的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCCCAGGCGGCCGCACCTGAACTCCTGGGG
GGAC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCCGGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAG
GGAGAGGCTC-3。
4.根据权利要求3所述的优化方法，其特征在于：所述扩增步骤中，优化
的Fc片段的扩增方法为：以野生型Fc基因片段为模板进行PCR反应，得到优
化的Fc片段；其中，PCR反应中采用的正向引物为5-TCGCTACCGTGGTGGCC
CAGGCGGCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCC-3，反向引物为5-GTGGTGGTGGTGGCC
GGCCTGGCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3。
5.根据权利要求2至4之一所述的优化方法，其特征在于：在扩增步骤完
成后，还包括表达与纯化步骤；所述表达与纯化步骤具体为：将SfiI酶切后
的优化Fc片段与原核表达载体进行连接、转化相应的表达宿主菌得到优化Fc
菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚睿，陈小波，张哲，
申请(专利权)人：武汉班科生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42