本发明专利技术提供了一种药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法及所用染料新用途，采用能够特异染色细胞膜、通过胞吞作用进入细胞内的细胞膜荧光染料标记细胞脱颗粒模型上的囊泡循环现象，基于影像学信息进行分析，以高内涵系统作为检测手段，在高内涵系统上检测药物注射剂所导致细胞内荧光增强来反映细胞发生脱颗粒状况，通过荧光强度转化计算方法计算细胞脱颗粒阳性率来预测药物注射剂引发过敏类过敏反应的机会，所用染料包括FM4-64、FM1-43、AM1-43或AM4-66；所述检测方法操作简单，结果客观，具有重要应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞生物学和药学领域，尤其是药物注射剂过敏类过敏反应的检测方 法及所用染料新用途。
技术介绍
药物注射剂在危重疾病治疗中发挥重要作用，但不良反应一直是困扰其临床应用 的主要问题。在药物注射剂不良反应中，过敏/类过敏反应一直高居首位，因此，快速检测 药物注射剂过敏/类过敏反应对注射剂安全性生产和临床应用具有重要意义。 药物注射剂过敏/类过敏反应传统评价方法包括整体动物检测方法和细胞生化 介质检测方法两类。整体动物检测方法采用大/小鼠、豚鼠、犬、食蟹猴等动物，通过观察 给药后出现的过敏症状，检测血液中过敏物质的含量变化，测定过敏介质引起的动物血压、 心律变化等指标来判断过敏反应的发生，但整体动物实验法需要使用大量动物，同时存在 动物种属差异大、个体间差异明显、观察指标主观性强等不足。细胞生化介质检测方法通 常采用细胞株或原代培养肥大细胞做模型，通过检测包括细胞脱颗粒释放的生化介质，如 0 -己糖苷酶、类胰蛋白酶和组胺或白介素等指标预测过敏反应发生，但采用细胞生化介质 检测方法，由于细胞脱颗粒释放介质种类较多，常导致不同检测指标之间的一致性差；如果 同时进行多指标检测，实验程序复杂而且成本增高，加之实验室环境因素影响较多，各实验 室报道的研究结果差异较大。同时，原代培养的肥大细胞来源于动物体内，虽然在一定程度 上节省了动物数量，但肥大细胞体外培养时间短，不能长期使用，仍难以解决动物用量大的 问题。因此，有必要发展一种简单快速的检测过敏/类过敏反应的新方法。 为了建立检测过敏/类过敏反应快速检测方法，有必要明确过敏反应和类过敏反 应间的联系和区别。过敏反应包括致敏阶段和抗原再刺激过程，但类过敏反应是类过敏原 刺激后直接引发而无需致敏过程；两者均可引起肥大细胞/嗜碱粒细胞脱颗粒释放过敏介 质，进而引起局部/全身过敏症状。可见，在过敏反应和类过敏反应发生的病理生理过程 中，肥大细胞脱颗粒是共同的关键反应步骤。因此，以细胞脱颗粒为考察关键指标预测过敏 /类过敏反应发生具有重要应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法。 本专利技术所要解决的另一技术问题在于提供上述检测方法中所用染料的新用途。 为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是： 药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，采用能够特异染色细胞膜、通过胞吞作 用进入细胞内的细胞膜荧光染料标记细胞脱颗粒模型上的囊泡循环现象，基于影像学信息 进行分析，以高内涵系统作为检测手段，在高内涵系统上检测药物注射剂所导致细胞内荧 光增强来反映细胞发生脱颗粒状况，通过荧光强度转化计算方法计算细胞脱颗粒阳性率来 预测药物注射剂引发过敏类过敏反应的机会。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞膜荧光染料为FM 类染料或AM类染料。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞膜荧光染料为 FM4-64、FM1-43、AM1-43 或AM4-66。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞脱颗粒模型包括 RBL-2H3细胞株、P815细胞株或Ku812细胞株。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述细胞脱颗粒模型为 RBL-2H3细胞株（大鼠嗜碱性白血病细胞）时，用MEM完全培养基培养于37°C、饱和湿度的 5% 0)2培养箱中，当细胞增长至80%丰度时进行传代，传代比例为1:5,约每三天传代一 次。 所述MEM完全培养基含1 %PS双抗、10%FBS和89%MEM基础培养基。 上述RBL-2H3细胞株（大鼠嗜碱性白血病细胞）是从Wistar大鼠保持肿瘤状态 的嗜碱性细胞中分离和克隆而来，该细胞具有高亲和力的IgE受体，被广泛用于肥大细胞 功能研究；由于RBL-2H3细胞具有永生化特性，培养方法简单，生长迅速，避免了由体内分 离肥大细胞的繁琐过程，因此是建立体外过敏反应和类过敏反应的良好细胞模型。所述 RBL-2H3细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述高内涵系统作为检测 手段，具体方法为：细胞接种于孔板中后，加入Hoechst33342染色细胞核，共孵育30min后 洗去染料，然后加入细胞膜荧光染料溶液，再次共孵育30min后进行高内涵检测，获得细胞 荧光图像；发生脱颗粒的细胞胞质内荧光强度明显升高，计算胞质内荧光强度增加的细胞 个数，据此细胞脱颗粒的阳性细胞百分率。 优选的，上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，所述高内涵系统中细胞脱 颗粒的阳性细胞百分率的具体计算方法为：采用软件分析高内涵系统所获得的细胞荧光图 片，首先根据H〇echst33342染色的细胞核来识别图片中所有细胞，然后计算每个细胞胞质 中FM4-64荧光强度；按照8%脱颗粒率来确定空白对照组荧光强度值，然后采用此荧光强 度值去分析同批阳性对照组和测试药物组中的荧光增强阳性细胞数目，凡是细胞内荧光强 度高于对照组荧光强度值者确定为阳性细胞，每个测试孔内按照：细胞脱颗粒率=阳性细 胞总数/细胞总数计算，细胞脱颗粒率越高，提示测试样品引起过敏/类过敏反应的几率越 大。 对于本身有颜色的注射剂，比如大多数中药注射剂，需要首先考察注射剂本身颜 色对所用荧光染料的荧光强度是否存在影响，如果存在影响，需要基于多批注射剂在不同 浓度与荧光染料相互作用数据，计算得出不同浓度下的影响系数，空白对照组荧光强度值 经系数转化后用于分析相应浓度下的测试样品阳性细胞，计算相应细胞脱颗粒率。 上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法中所用细胞膜荧光染料作为药物注 射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。 优选的，上述细胞膜荧光染料的新用途，所述细胞膜荧光染料为FM4-64、FM1-43、 AM1-43 或AM4-66，即：FM4-64作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。 FM1-43作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。 AMI-43作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。AM4-66作为药物注射剂过敏类过敏反应的检测试剂方面的新用途。本专利技术的有益效果是： 上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法以细胞膜特异荧光染料为工具，采用 高内涵系统对囊泡循环引起的细胞内荧光强度增加进行检测，据此确定细胞发生了脱颗粒 现象，进而计算细胞脱颗粒率预测过敏/类过敏反应发生；所用染料为水溶性苯乙烯类复 合物，对细胞无毒性，在水相中没有荧光，只有插入生物脂质膜后才显示荧光，能够与细胞 质膜及细胞器膜特异结合后发出高强度荧光；囊泡循环过程包括囊泡转运、定向、锚定、细 胞膜融合和囊泡回收等步骤，其中囊泡回收能够将膜上的特异荧光染料内吞，引起细胞内 荧光染料积累，造成胞内荧光强度增加；高内涵系统（highcontentsystem，HCS)特点是基 于影像学对细胞功能进行分析，高内涵系统包括腔室玻片、多孔板以及组织芯片扫描等多 种可调节扫描模式，系统扫描后获取的图像可传输到本地服务器进行存储和有效分析，同 时系统配有多种图像分析方法，可根据研究目的进行多指标分析，具有高通量筛选能力。 上述药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，操本文档来自技高网...
【技术保护点】
药物注射剂过敏类过敏反应的检测方法，其特征在于：采用能够特异染色细胞膜、通过胞吞作用进入细胞内的细胞膜荧光染料标记细胞脱颗粒模型上的囊泡循环现象，基于影像学信息进行分析，以高内涵系统作为检测手段，在高内涵系统上检测药物注射剂所导致细胞内荧光增强来反映细胞发生脱颗粒状况，通过荧光强度转化计算方法计算细胞脱颗粒阳性率来预测药物注射剂引发过敏类过敏反应的机会。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐砚通，高秀梅，吴红华，王化龙，李振虎，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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