用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，它由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，然后转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白经过Ni亲和层析柱进行纯化，分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗脱，收集对应流出液后用10KD的超滤膜浓缩。本发明专利技术首次构建了用于高效表达Pvs25的重组杆状病毒，为研究间日疟传播阻断候选疫苗提供一种新途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原 Pvs25的重组杆状病毒，以及该病毒的构建方法，以及该病毒所表达的融合蛋白的纯化方 法。
技术介绍
疟疾是一种由疟原虫造成的，通过以按蚊为主要媒介传播的全球性急性寄生虫传 染病。据世界卫生组织统计，全球大约有3. 2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约 1〇〇万人的性命并导致4亿人感染，每年感染疟疾致死的人群中，92%为五岁以下的儿童，而 每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了 10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和 疟原虫抗药性的出现使得传统的药物治疗疟疾方法面临更加严峻的挑战。因而一种全新的 疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。 在已知的很多种疟疾候选疫苗中，传播阻断疫苗的前景是很好的，其中间日疟传 播阻断候选抗原中Pvs25在疟疾的传播过程中发挥重要作用，对Pvs25的研究也是很广泛。 现在的生物技术常用的生物体是各种种类的酵母菌核大肠杆菌，但是通过大肠杆菌表达出 来的Pvs25蛋白在传播阻断实验中并没有检测到有明显的免疫原性和免疫保护性，而用酵 母其中的毕赤酵母表达的PVS25蛋白可以有很好的表达，得到的抗体也可以检测到免疫原 性和保护性，而且已经进入了临床I期，但是在进入下一期临床的时候，人体产生了排斥反 应。现如今表达的哺乳动物表达系统可以看到效果，但是表达量很低，成本相对较高，不满 足大量生产需要。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种用于表达间日 疟传播阻断候选抗原PVS25的重组杆状病毒，该病毒在家蚕BmN细胞中传代培养细胞获得 F3代病毒，以此F3代病毒接种家蚕五龄幼虫，检测重组杆状病毒Pvs25在家蚕五龄幼虫中 的高效表达。此种方法相比较原核的和其他的真核表达系统表达蛋白的方法具有表达量 高、安全性好、生产成本低、易于大规模生产操作的特点。 本专利技术所采用的技术方案为： -种用于表达间日痕传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25,它由 间日痕传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体 Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因 组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25 的重组杆状病毒。具体地，所述Pvs25基因具体插入到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和Xhol酶切位点之间。 具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 本专利技术进一步提供用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒 BmPvs25的构建方法，包括以下步骤： (1)通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25 基因连接到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和Xhol酶切位点之间，得到重组转座质粒 pFastBacHTB-Pvs25； (2)将重组转座质粒pFastBacHTB_Pvs25转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的 大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal 和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40_48h后挑取白斑，白斑继续培养 24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定； (3)取步骤（2)鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕 BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为 表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。 本专利技术还进一步提供上述重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白的纯化方法， 包括以下步骤： (1)选用Ni亲和层析柱，Bindingbuffer平衡后将收集的含目的蛋白的液体上样， 室温孵育15min; (2)收集穿透液，用10倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子，并收集流出液； (3)分别用 5 倍柱体积的 20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗 柱子，并收集对应的流出液，然后将每一个咪唑梯度的样品用10KD的超滤膜浓缩至lmL; (4)将每一个收集的样品进行制样，然后SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。鉴 定结果表明，间日痕传播阻断候选抗原Pvs25融合蛋白在重组杆状病毒BmPvs25内高效表 达。 与现有技术相比，本专利技术具有以下显著优点和有益效果： (1)间日疟传播阻断候选抗原PVS25基因是一个编码217个氨基酸的基因序列， 其中含有4个EGF-like结构域，本研究中所用到的是经过优化后的编码137个氨基酸的 Pvs25序列，利用经过改造后的Pvs25序列作家蚕杆状病毒系统的研究。本专利技术首次构建了 用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，利用家蚕五龄幼虫作为生物反 应器，使目的蛋白可以达到高表达量，安全性好，生产成本低，产量高，适用于大规模生产。 该家蚕杆状病毒高效表达系统表达具有临床应用价值。 (2)本专利技术利用家蚕杆状病毒表达的传播阻断候选疫苗具有翻译后的修饰，可以 得到比原核表达相对有正确构象的抗原，可以达到好的免疫原性。【附图说明】 图1所示的是重组转移质粒pFastBacHTB_Pvs25的构建示意图。 图2所示的是重组转移质粒PFastBacHTB-Pvs25的PCR和双酶切鉴定图，其中M: DNAmarker;1:PCR产物；2:BamHI/XhoI酶切产物。 图3所示的是家蚕重组杆状病毒BmPvs25的PCR鉴定图，其中M:DNAmarker;1: M13F和M13R为上下游引物PCR结果；2 :M13F和目的基因下游为上下游引物PCR结果；3: 目的基因上游和Ml3R为上下游引物PCR结果。 图4所示的是Pvs25融合蛋白在家蚕BmN细胞中表达的Westernblotting图，其 中M:低分子量蛋白标准；1 :正常细胞；2 :接种了重组BmPvs25的发病细胞。 图5所示的是Pvs25融合蛋白在纯化各步骤中样品的Westernblotting图，其中 M:Marker;1 :500mM咪唑洗脱液制样；2 :300mM咪唑洗脱液制样；3 :200mM咪唑洗脱液制 样；4 :150mM咪唑洗脱液制样；5 :100mM咪唑洗脱液制样；6 :50mM咪唑洗脱液制样；7 :20mM 咪唑洗脱液制样；8 :流出液制样；9 :穿透液制样。 序列表信息：SEQIDN当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，盛稳稳，郭庆拓，舒特俊，陈剑清，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12