检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒。该试剂盒含有用于检测PIK3CA基因第19外显子基因突变的物质，还可含记载有如下内容的说明书：若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐药的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了K944N、F930S、V955G、V955I和K966E突变中的至少一种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐药。实验证明，PIK3CA的第19外显子突变与KRAS突变一样，在西妥昔单抗的继发耐药中发挥着重作用，本发明专利技术对于临床上检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒及其应用。
技术介绍
尽管结直肠癌的发病率和死亡率在全世界范围内存在很大差异，但在多数发达国家，结直肠癌一直是第3位癌症相关的死亡原因。靶向表皮生长因子受体(EpidermalGrowthFactorReceptor,EGFR)的单抗如西妥昔单抗、帕尼单抗在RAS野生型的转移性结直肠癌患者(mCRC)的治疗中可显著改善患者的生存，因此被推荐用于RAS野生型的mCRC的治疗。尽管目前RAS基因检测已作为患者选择EGFR单抗的常规检测，仍有30-40％的RAS野生型患者对EGFR单抗治疗无效。更重要的是，绝大部分RAS野生型的患者在接受EGFR单抗治疗后仍然会发生耐药。因此，在影像学确认治疗无效之前，及时监测耐药的发生，以避免不必要的延长无效治疗，对指导EGFR单抗临床应用具有非常重要的意义。近期的研究报道了EGFR信号通路下游的一系列基因，如BRAF、PIK3CA和PTEN可能与EGFR单抗的耐药有关。但多个研究得出了矛盾的结论，而且在耐药相关研究中，传统的方法是关注治疗前肿瘤组织中已有的体细胞突变，监测其在治疗过程中的变化，但这样的策略可能忽略治疗过程中的新发突变，导致无法充分评估与耐药有关的基因突变。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒。本专利技术所提供的用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒，具体含有用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质。所述试剂盒中还可含有记载有如下内容的说明书：若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐药的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了如下(a)-(e)突变中的至少一种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐药：(a)所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺(K944N)；(b)所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸(F930S)；(c)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸(V955I)；(d)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸(V955G)；(e)所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸(K966E)。在本专利技术中，以上各突变对应于基因水平，具体体现为：所述(a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T；所述(b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C；所述(c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A；所述(d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G；所述(e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。其中，所述PIK3CA基因第19外显子(野生型)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质，在制备用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒中的应用，也属于本专利技术的保护范围。在所述应用中，所述PIK3CA基因第19外显子的基因突变为如下中的至少一种：(a)所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺(K944N)；(b)所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸(F930S)；(c)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸(V955I)；(d)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸(V955G)；(e)所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸(K966E)。在本专利技术中，以上各突变对应于基因水平，具体体现为：所述(a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T；所述(b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C；所述(c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A；所述(d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G；所述(e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。其中，所述PIK3CA基因第19外显子(野生型)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。在所述试剂盒，或所述应用中，所述用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质为引物对1和/或引物对2；所述引物对1为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述引物对2为由序列表中序列4和序列5所示的两条单链DNA分子组成的引物对。本专利技术借助深度测序技术，分析治疗前或治疗过程中血浆ctDNA的突变，希望藉此对西妥昔单抗耐药相关的突变有一个更综合的认识。最终确认了ctDNA中与西妥昔单抗的耐药显著相关的PIK3CA基因第19外显子的5种点突变，分别是K944N、F930S、V955I、V955G和K966E。在全部32例继发耐药患者中，7例(21.9％)患者出现了PIK3CA突变，8例(25％)患者出现KRAS突变，在12例原发耐药患者的治疗前血浆中，有5例出现了PIK3CA突变。因此，PIK3CA基因突变对西妥昔单抗耐药的贡献与KRAS基因相似。体外实验表明，与野生型的PIK3CA相比，PIK3CA突变体可显著促进下游信号AKT的磷酸化，并可导致结肠癌细胞DiFi对西妥昔单抗耐药。本专利技术证实了PIK3CA基因突变是导致西妥昔单抗耐药的重要因素；在耐药相关的基因突变研究中，基于治疗前和治疗过程中系列血浆标本的目标基因扩增子深度测序是可行且有效的方法。且PIK3CA基因突变的出现早于影像学评价的耐药时间，这对于指导转移性结直肠癌患者的临床用药具有重要意义。附图说明图1为ctDNA中的耐药相关突变在各个基因中的分布情况。图2为ctDNA中基因突变频率与影像学疗效评价和肿瘤标志物的动态趋势比较。A为2号患者；B为12号患者；C为7号患者；D为17号患者。每个图的上半部代表结直肠癌常用的肿瘤标志物CEA(ng/ml)、CA199(U/ml)在治疗过程中的动态变化，横坐标代表影像学疗效评价结果：Baseline基线(治疗前)，SD疾病稳定，PR部分缓解(有效)，PD疾病进展(耐药)。下半部代表ctDNA中检测到突变基因的百分率的动态变化，横坐标代表开始治疗的天数，时间上与上半部横坐标一致。AF：突变基因的百分率。在影像学确定疾病进展之前突变基因已经出现ctDNA中，并呈现上升趋势。图3为PIK3CA突变基因的蛋白结构建模。1，F930侧链可与Tyr836侧链形成π键相互作用；2，F930S突变后，该作用消失；3，K944侧链可与α调节亚单位的D464形成酸碱吸引作用；4，K944N突变后，该作用消失，N944侧链可与α调节亚单位的N453、Q457和R577侧链形成氢键相互作用，会造成PIK3CA在此处发生较大构象变化。5，V952和V955均形成疏水侧链；6，7，V952A和V955G突变均使相应位置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒，含有用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质。

【技术特征摘要】
2014.11.10 CN 20141064528201.一种用于检测或辅助检测西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌耐药的试剂盒，含有用于检测PIK3CA基因第19外显子是否发生基因突变的物质；其中，所述PIK3CA基因第19外显子的基因突变为如下中的至少一种：(a)所述PIK3CA基因编码蛋白的第944位氨基酸由赖氨酸突变为天冬酰胺；(b)所述PIK3CA基因编码蛋白的第930位氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸；(c)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸；(d)所述PIK3CA基因编码蛋白的第955位氨基酸由缬氨酸突变为甘氨酸；(e)所述PIK3CA基因编码蛋白的第966位氨基酸由赖氨酸突变为谷氨酸。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有记载有如下内容的说明书：若作为待测者的拟接受西妥昔单抗治疗或正在接受西妥昔单抗治疗尚未发生耐药的转移性结直肠癌患者的PIK3CA基因第19外显子发生了所述(a)-所述(e)突变中的至少一种，则所述待测者在接受或继续接受西妥昔单抗治疗转移性结直肠癌时会或候选会发生耐药。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述(a)为所述PIK3CA基因第19外显子的第48位由A突变为T；所述(b)为所述PIK3CA基因第19外显子的第5位由T突变为C；所述(c)为所述PIK3CA基因第19外显子的第79位由G突变为A；所述(d)为所述PIK3CA基因第19外显子的第80位由T突变为G；所述(e)为所述PIK3CA基因第19外显子的第112位由A突变为G。4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测PIK...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建明，王岩，王焱，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇七医院，
类型：发明
国别省市：北京;11