捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，该检测试剂盒包括三对引物：F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；内引物FIP：5'- ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；内引物BIP：5'-TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3'；促环引物LF：5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3'；促环引物LB：5'- TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。本发明专利技术试剂盒具备特异性强，灵敏度高的特点，对捻转血矛线虫的DNA检测限达到45.1 pg/ul。

【技术实现步骤摘要】
捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于寄生虫分子检测
，具体涉及一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法。技术背景捻转血矛线虫呈世界性分布，严重影响畜牧业的发展。捻转血矛线虫成虫寄生于真胃，以虫体的前端刺入胃黏膜引起损伤，造成真胃炎症和出血；分泌毒素影响造血功能、消化液的分泌紊乱和对饲料的消化吸收障碍，使病羊呈现营养不良等一系列的症状；有时引起致死性的进行性贫血；可导致肝坏死和肝细胞脂肪变性，并有时伴发缺铁；常造成羊的大量死亡，尤其是羔羊的死亡最为严重，对畜牧业造成极大经济损失(李国清，赵俊龙，杨晓野等.兽医寄生虫学.中国农业大学出版社.2006：200-203.)。核糖体第一内转录间隔(ITS-1)和第二内转录间隔(ITS-2)是大家比较公认的用于虫种鉴定的遗传标记，已应用于线虫虫种鉴定(Gasser,R.B.,Hu,M.,Chilton,N.,Campbell,B.,Jex,A.,Otranto,D.,Cafarchia,C.,Beveridge,I.,Zhu,X.,2006.Single-strandconformationpolymorphism(SSCP)fortheanalysisofgeneticvariation.Nat.Protoc.1,3121–3128.Gasser,R.B.,Bott,N.J.,Chilton,N.B.,Hunt,P.,Beveridge,I.,2008.Towardpractical,DNA-baseddiagnosticmethodsforparasiticnematodesoflivestock-bionomicandbiotechnologicalimplications.Biotechnol.Adv.26,325–334.)。2006年，NathanJ.Bott等人设计针对捻转血矛线虫ITS-2基因的特异性PCR引物来通过PCR的方法鉴别捻转血矛线虫(NathanJ.Bott.,BronwynE.Campbell.,IanBeveridge.,NeilB.Chilton.,DianneRees.,PeterW.Hunt.,RobinB.Gasser.,2009.Acombinedmicroscopic-molecularmethodforthediagnosisofstrongylidinfectionsinsheep.InternationalJournalforParasitology.39(2009):1277–1287.)。基于分子水平对捻转血矛线虫ITS-2基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但是普通PCR、多重PCR以及荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用高，对检测人员要求较高的技术等，无法在条件较差的基层实验室进行。环介导等温扩增法(1oopmediatedisothermalamplification，LAMP)可以在等温条件下高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供60℃恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)。不仅大大降低了检测的费用，而且给临床应用带来极大方便(Notomi,T.,Okayama,H.,Masubuchi,H.,Yonekawa,T.,Watanabe,K.,Amino,N.,Hase,T.,2000.Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes.28,E63.)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒，该试剂盒包括三对特异性引物，外引物F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；内引物FIP：5'-ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；内引物BIP：5'-TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3'；促环引物LF：5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3'；促环引物LB：5'-TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。本专利技术的目的在于提供一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测方法。该方法快速、灵敏、特异而又简单实用。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测试剂盒，根据已报道的登录号为X78803.1的捻转血矛线虫ITS-2基因序列(见序列表SEQIDNO：1所示)，设计三对特异性引物：外引物F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；(对应序列表SEQIDNO：2)外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；(对应序列表SEQIDNO：3)内引物FIP：5'-ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；(对应序列表SEQIDNO：4)内引物BIP：5'-TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC-3'；(对应序列表SEQIDNO：5)促环引物LF：5'-GTTCTTGAACTGAAATGGGAA-3'；(对应序列表SEQIDNO：6)促环引物LB：5'-TTGAGTGTACTCAGCGAATATT-3'。(对应序列表SEQIDNO：7)一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测方法，步骤包括：(1)样品总DNA提取；(2)环介导的等温扩增：1)建立环介导的等温扩增(LAMP)反应体系：2.5μL10倍体积的BstDNA聚合酶缓冲液，2mMMgCl2，0.8M甜菜碱，0.4mMdNTPs，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各0.6μM，促环引物LF和LB各0.28μM，8UBstDNA聚合酶，2μLDNA模板，用灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为用单条成虫提取的捻转血矛线虫基因组DNA，阴性对照为灭菌双蒸水；2)环介导的等温扩增反应：DNA经95℃预变性5min，向预变性的DNA中加入上述除DNA以外的反应体系中，再将其放置于63℃反应60min，然后于80℃作用10min后终止反应；3)扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。显色反应：将1000倍体积的荧光显色剂SYBRGreenI进行10倍稀释，之后取2μL加入至25μL的环介导等温扩增的最终产物中，在自然光下用肉眼观察扩增产物的显色情况。若扩增产物变为黄绿色则为捻转血矛线虫阳性，若扩增产物为红棕色则为捻转血矛线虫阴性。琼脂糖凝胶电泳：取25μL的环介导等温扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物为由不同大小的区带组成的阶梯式图谱为捻转血矛线虫阳性。上述方法也可用于捻转血矛线虫的环介导等温扩增非诊断性检测。本专利技术所设计的三对特异引物成功建立了对捻转血矛线虫快速、灵敏、特异而又简单实用的捻本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测引物，包括外引物F3：5'‑TGTGGCTAATTTCAACATTGT‑3'；外引物B3：5'‑AAGAACATCGTCGCCATACA‑3'；内引物FIP：5'‑ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG‑3'；内引物BIP：5'‑TCCCTGAATGATATGAACATGTTTGTCACTATCTAAGTCAATC‑3'；促环引物LF：5'‑GTTCTTGAACTGAAATGGGAA‑3'；促环引物LB：5'‑TTGAGTGTACTCAGCGAATATT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种捻转血矛线虫的环介导等温扩增检测引物，包括外引物F3：5'-TGTGGCTAATTTCAACATTGT-3'；外引物B3：5'-AAGAACATCGTCGCCATACA-3'；内引物FIP：5'-ACAATTTCATAACATCACGTTGCCAAATGGCATTTGTCTTTTAG-3'；内引物BIP：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨新，胡敏，冯汉利，方瑞，朱凯祥，漆明伟，张宗泽，谭理，雷卫强，周艳琴，赵俊龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42