一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵敏快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血液、尿液中亚硝酸盐的快速检测方法。利用亚硝酸盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，用非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO系列进行浊点萃取，具有操作条件温和、浊点温度低、分相时间短、萃取效率高等特点。体系中亚硝酸盐检测限可达0.005µg/mL。该发明专利技术具有简单、快速、灵敏度高、可现场检测等特点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种血液、尿液中亚硝酸盐的快速检测方法。利用亚硝酸盐与Griess试剂发生重氮化偶合反应，形成偶氮化合物，用非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO系列进行浊点萃取，具有操作条件温和、浊点温度低、分相时间短、萃取效率高等特点。体系中亚硝酸盐检测限可达0.005μg/mL。该专利技术具有简单、快速、灵敏度高、可现场检测等特点。【专利说明】
本专利技术属于体内药物检测
，具体涉及一种血液和尿液中亚硝酸盐的高灵 敏快速检测方法。
技术介绍
-氧化氮（N0)是一种带有不成对电子的气体，化学性质不稳定，半衰期很短，仅有 几秒钟，易形成亚硝酸盐和硝酸盐。N0是目前所知的最强的血管舒张因子和收缩因子，它 能作为介质、信使、递质或细胞功能调节因子参与集体许多生理或病理过程。N0是调节心 肌正常生理活动的重要分子，具有使血管扩张，抑制血小板聚集与黏附，抗炎症，抑制细胞 凋亡、增生等作用。人类有60万亿细胞，一氧化氮在人体内扮演着细胞间的传导因子的角 色，也是重要的"信号分子"。作为相对稳定的N0代谢产物，亚硝酸盐（NCV)在最近10年成 为世界医学界的热点，通过测定尿液、血液中的NCV的含量来反映体内N0含量和作为反应 多项身体机能的重要指标或疾病诊断。 目前亚硝酸盐检测最通用的方法是食品安全国家标准GB5009. 33- 2010,该标准 第一法中采用离子色谱法检测各类食品中的亚硝酸盐和硝酸盐，第二法为分光光度法。同 时，亚硝酸盐的测定还有荧光光度法、高效液相色谱法等。食品中亚硝酸盐一是含量相对 高，二是基本没有盐的干扰，离子色谱法及光度法都是较适合的检测方法，而体内血液或尿 液中亚硝酸盐却含量低，有较高盐含量，基体干扰严重。目前检测通常用Griess检测试剂 盒，由于受到检测灵敏度的限制及基体干扰，通常很难检测出亚硝酸盐，其灵敏度通常只能 达到lKg/mg。研究小组之前已利用高效液相色谱（HPLC)对血液尿液及组织中硝酸盐与亚 硝酸盐检测进行了研究，取得了不错的效果，申请了专利技术专利（201310129291.X)，同时还将 亚硝酸盐与Griess试剂反应，经浊点萃取（CPE)进行分离、富集，直接目视比色，进行血液 尿液中亚硝酸盐简单快速检测，申请了专利技术专利（201310274145. 6)。进一步更加深入研究 发现，用非离子表面活性剂AE0系列作浊点萃取剂，与Triton系列及其他非离子表面活性 剂相比，该表面活性剂能达到相似或更高的萃取效率，由于不含芳环，更加环保、环境中易 降解，同时本专利技术通过研究发现几种有机醇可以使AE0系列浊点温度降低，分相时间更短， 具有检测更加快速简便、灵敏的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简单快速、灵敏度、能现场检 测、尿液中亚硝酸盐定性、半定量的方法。 本专利技术的目的通过以下技术方案予以实现。 除非另有说明，本专利技术所采用的百分数均为重量百分数。 -种血液和尿液中亚硝酸盐的检测方法，包括以下步骤： (1)亚硝酸盐标准色阶制作：取浓度为5.OPg/mL的N02_标准溶液0. 005、0. 01、0. 05、 0. 10、0. 30、0. 70、1.OmL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250ML，混 合均勻；lmin后加入GriessB试剂250ML，混合均勻，加入非离子表面活性剂0.lmL，降池点 和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵〇. 1?〇. 5g或有机醇0. 05?0. 2mL，润旋混合lmin，离心 分相，在溶液上层出现由浅至深的红色环色阶溶液； (2)样品检测： 尿液的检测：取10mL尿液，加入蛋白沉淀剂硫酸锌0. 4?1. 0g，活性炭0. 5?1. 0g，混 合均匀，离心脱色、脱蛋白，滤纸过滤除去脱色剂和蛋白沉淀剂；取5mL处理后的尿液，加入 GriessA试剂250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250ML，混合均勻，放置5min后， 加入非离子表面活性剂〇.lmL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0. 1?0. 5g或有机 醇0. 05?0. 2mL，涡旋混合lmin，离心分相，将溶液上层表面活性剂的颜色与步骤（1)标准 色阶比较，判断其含量； 血液的检测：取5mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入活性炭0.5?l.Og、 蛋白沉淀剂0.lmol/L氢氧化钠溶液0. 2mL和硫酸锌0. 2g，混合均匀，加入乙腈lmL，离心 分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馈水定容至5mL,加入GriessA试剂250ML，混 合均勻；lmin后加入GriessB试剂250ML，混合均勻，放置5min,加入非离子表面活性剂 0.lmL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0. 1?0. 5g或有机醇0. 05?0. 2mL，涡旋混 合lmin，离心分相，将溶液上层表面活性剂的颜色与步骤（1)标准色阶比较，判断其含量； 其中，步骤（1)(2)中所述的GriessA试剂为50mg对氨基苯磺酸溶于5mL盐酸（0. 5mol/ L) ;GriessB试剂为4mgN-1-萘乙二胺盐酸盐溶于4mL甲醇（50%); 所述非离子表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-3、AEO-7、AE0-9之一种； 有机醇包括：正辛醇、正戊醇、正癸醇之一种； 所述的离心条件为离心时间5?15min，离心速率3000?10000r/min。 相对于现有技术，本专利技术具有以下显著优点： 1、所采用的新型非离子表面活性剂AE0系列浊点（30°C)低，与通用浊点萃取表面活性 剂Triton系列浊点（40°C)或其他非离子表面活性剂相比，浊点明显降低，操作条件温和。 与其他传统表面活性剂在相同条件下进行浊点萃取，萃取时间短、萃取率更高，用目视比色 灵敏度达到了 〇.〇〇5Mg/mL。 2、非离子表面活性剂AE0系列为脂肪醇聚氧乙烯醚，不含芳环，环保、易降解，其 价格低廉。 【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步地说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。 实施例1 利用本专利技术检测人体尿液中亚硝酸盐的含量。 1、亚硝酸盐标准色阶制作：取浓度为5.OPg/mL的N02_标准溶液0. 005、0. 01、 0. 05、0. 10、0. 30、0. 70、1.OmL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂 250ML，混合均勻；lmin后加入GriessB试剂250ML，混合均勻，放置5min后，加入非离子表 面活性剂AE0-9 0.lmL，硫酸铵0. 2g，润旋混合lmin，5000r/min离心10min后分相，在溶 液上层出现由浅至深的红色环色阶溶液； 2、样品处理及测定结果 取10mL尿液于10mL离心管中，加入1.Og活性炭，0. 2g硫酸铵，混合均勻，4000r/ min离心lOmin，滤纸过滤除去活性炭和蛋白沉淀。取5. OmL脱色、脱蛋白后的尿液于10mL 离心管中，加入GriessA试剂250ML，混合均勻。lmin后加入GriessB试剂250ML，混合均勻， 放置5min后，加入非离子表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血液和尿液中亚硝酸盐快速检测方法，包括以下步骤：（1）制备亚硝酸盐标准色阶溶液：取浓度为5.0µg/mL 的NO2‑ 标准溶液0.005、0.01、0.05、0.10、0.30、0.70、1.0mL于刻度离心管中，用蒸馏水稀释至5mL，加入GriessA试剂250µL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250µL，混合均匀，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，溶液上层表面活性剂相出现由浅至深的红色环色阶；（2）检测尿液中的亚硝酸盐：取10mL尿液，硫酸锌0.4～1.0g，加入活性炭0.5～1.0g，混合均匀，离心脱色，滤纸过滤除去活性炭；取5mL脱色后的尿液，加入GriessA试剂250µL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250µL，混合均匀，放置5min后，加入非离子表面活性剂0.1mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，将溶液上层表面活性剂相的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量；（3）检测血液中的亚硝酸盐：取5 mL新鲜血液，放入离心机中离心，取上清液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液0.2mL和硫酸锌0.2g,混合均匀，加入乙腈1mL，离心分离，取上清液2mL于10mL离心管中用蒸馏水定容至5mL,加入GriessA试剂250µL，混合均匀；1min后加入GriessB试剂250µL，混合均匀，放置5min, 加入非离子表面活性剂0.2mL，降浊点和相分离促进剂氯化钠或硫酸铵0.1～0.5g或有机醇0.05～0.2mL，涡旋混合1min，离心5～15min分相，将溶液上层表面活性剂相的颜色与步骤（1）标准色阶比较，判断其含量。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亚玲，王军，赵娇，宁金艳，
申请(专利权)人：云南健牛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53