本发明专利技术涉及少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A及其产物Ssm-A1和Ssm-A2的制备。少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2具有结构简单、活性特殊的有益特点。本发少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2制备方法可从少棘蜈蚣毒液进行分离纯化获得。本发明专利技术还提供少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的应用，二者均具有对多种因素导致疼痛的镇痛作用，可应用于疼痛治疗药物的制备。
【技术实现步骤摘要】
少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A及其产物Ssm-A1和Ssm-A2的制备和应用
：本专利技术涉及少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A及其产物Ssm-A1和Ssm-A2的制备和应用,属生物医学领域。
技术介绍
蜈蚣是一味传统的重要动物药材，其中药药用已有2千多年的历史。蜈蚣性温，有毒，入肝经。辛温燥烈，走窜性猛，行表达里，无所不至，能搜风通络定惊，开痰行滞，解瘀定惊；亦能熄风定痛。解毒散结、活血化瘀通络，补虚兴阳起痿，祛湿散邪解毒，为单用或复方中要药(杨媚月等,2012蜈蚣外用的现状与展望,中成药，第34卷,第7期,1343-1346.)。我国药典中记载的少棘蜈蚣(Scolopendrasubspinipesmultilans)的功能与主治为：息风镇痉，通络止痛，攻毒散结。用于肝风内动，痉挛抽搐，小儿惊风，中风口喁，半身不遂，破伤风，风湿顽痹，偏正头痛，疮疡，瘰疬，蛇虫咬伤(国家药典委员会，2010中国药典(一部)，北京:中国医药科技出版社，335-336页)。少棘蜈蚣粗毒中有磷酸酶A、蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶、精氨酸酯酶、类凝血酶、纤维素酶、α-淀粉酶、透明质酸酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶等10种酶,还有羟肽酶、ATP酶、核苷酸焦磷酸酶、氨基酸萘胺酶、精氨酸酯酶等(陶勇,2000蜈蚣毒的研究进展,中国生化药物杂志,第21卷，第2期，94-95页)。随着对疼痛相关分子生物学的日益深入，揭示了离子通道在疼痛的发生和发展中起着重要作用。近年来，少棘蜈蚣中作用于Na+，K+，Ca2+等离子通道的成分研究有了长足的进展，在一定程度上阐明了少棘蜈蚣镇痛的分子基础(Yangetal,2012Chemicalpunchpackedinvenomsmakescentipedesexcellentpredators,MolCellProteomics,11:640-650；Chenetal,2014IsolationandcharacterizationofSsmTx-I,aSpecificKv2.1blockerfromthevenomofthecentipedeScolopendraSubspinipesMutilansL.Koch,JPeptSci.20:159-164)。但少棘蜈蚣中与其临床通络止痛功效相关的物质基础研究仍显不足。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A及其产物Ssm-A1和Ssm-A2的制备方法。由于少棘蜈蚣毒腺对前体蛋白Ssm-A翻译后加工的差异，产生了Ssm-A1和Ssm-A2的天然镇痛肽。Ssm-A1和Ssm-A2的区别在于Ssm-A1比Ssm-A2在小肽的N-端多出了AsnSerLysTyr4个氨基酸残基。Ssm-A1和Ssm-A2具有结构简单、可通过少棘蜈蚣粗毒分离纯化得到的有益特点。本专利技术的另一个目的是提供少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的应用，Ssm-A1和Ssm-A2均具有镇痛活性强的有益特点，可应用于疼痛治疗药物的制备。本专利技术涉及的少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2，是从国产少棘蜈蚣毒液中分离得到的，少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1的氨基酸序列如下(SEQIDNO:2)：少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A2的氨基酸序列如下(SEQIDNO:3)：本专利技术提供的少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，由少棘蜈蚣粗毒中得到。上述方法制备的少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2可通过质谱及镇痛活性进行鉴定。少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的制备也可通过本领域常规的方法，采用化学合成或基因表达的方式得到，它们的氨基酸序列与本专利技术SEQIDNO:2和SEQIDNO:3相同。上面所述少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的应用，所述镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2在临床治疗上的应用。下面以制备的具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示氨基酸序列的少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2为例来进行说明：Ssm-A1(SEQIDNO:2)：Ssm-A2(SEQIDNO:3)：少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2在小鼠醋酸扭体实验、鼠尾光照实验、甲醛疼痛模型第一相舔足时间和第二相舔足时间动物模型中均显示了较强的镇痛作用，揭示本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2对多种因素引起的疼痛均有较好的镇痛效果，有较好的临床应用前景。本专利技术的有益效果在于：从中国产少棘蜈蚣毒腺中得到了编码2个新颖的镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的前体蛋白Ssm-A，并分离纯化鉴定了源自前体蛋白Ssm-A的具有良好镇痛活性的Ssm-A1和Ssm-A2镇痛肽。将本专利技术的少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A，成熟镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的氨基酸序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同蛋白质和多肽。少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2具有结构简单、镇痛作用多样的有益特点。附图说明：图1为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的G-50分子筛层析图。图2为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的离子交换层析图。图3为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1的HPLC反相C18柱层析图。图4为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A2的HPLC反相C18柱层析图。图5为本专利技术分离纯化天然少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1的质谱图。图6为本专利技术分离纯化天然少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A2的质谱图。图7为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的醋酸扭体实验结果。图8为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的鼠尾光照实验结果。图9为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的甲醛引起的动物舔足反应第一相舔足时间实验结果。图10为本专利技术少棘蜈蚣镇痛肽Ssm-A1和Ssm-A2的甲醛引起的动物舔足反应第二相舔足时间实验结果。具体实施方式实施例1：少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A的一级结构测定1.1、少棘蜈蚣毒腺转录组测定少棘蜈蚣活体采自湖北随州，随机挑选4个个体，体视显微镜下4度分离少棘蜈蚣毒腺，立即放入液氮速冻。然后用干冰运输至深圳华大基因研究院进行少棘蜈蚣毒腺转录组测序。商业化少棘蜈蚣转录组测定的主要实验步骤如下：提取少棘蜈蚣毒腺样品总RNA并使用DNaseI消化DNA后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA；加入打断试剂在Thermomixer中适温将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化回收、粘性末端修复、cDNA的3'末端加上碱基“A”并连接接头，然后进行片段选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent2100Bioanalyzer和ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem质检合格后，使用IlluminaHiSeqTM2000进行测序。1.2、少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A一级结构上述步骤1得到的转录本数据经基因序列组装和基因表达分析后，得到了少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A的氨基酸全序列((SEQIDNO:1)：本专利技术的少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A全序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，本文档来自技高网...
【技术保护点】
少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm‑A，其特征在于：所述镇痛肽前体蛋白Ssm‑A具有下述序列表中的氨基酸序列SEQ ID NO:1： 。
【技术特征摘要】
1.少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A，其特征在于：所述镇痛肽前体蛋白Ssm-A由下述序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:1所示：MetMetLeuLysSerPheCysIleLeuSer10ValPheMetValLeuPheLeuAlaLysPhe20ProAspLeuCysSerGlyGluGluIleSer30ProLeuLysIleValValArgAsnSerLys40TyrLeuAsnAsnProCysAsnGlyValThr50CysProSerGlyTyrArgCysSerIleVal60AspLysGlnCysIleLysLysGluLys69。2.少棘蜈蚣镇痛肽前体蛋白Ssm-A的活性天然产物Ssm-A1，其特征在于：所述镇痛肽由下述序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:2所示：AsnSerLysTyrLeuAsnAsnProCysAsn10GlyValThrCysProSerGlyTyrArgCys20SerIleValAspLysGlnCysIleLysLys30Glu31。3....
【专利技术属性】
技术研发人员：张云，李文辉，杨新旺，张悦，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53
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