本发明专利技术公开了一种清除水体有机污染物的转基因水蕹菜的培育方法；本发明专利技术首先将含有cyp2e1基因的质粒载体转入发根农杆菌，利用发根农杆菌转基因法在活体植株上获得转cyp2e1基因的毛状不定根，进而获得含有cyp2e1基因毛状根的复合型转基因水蕹菜，利用这种复合型转基因植株对水体有机污染物进行吸收。
【技术实现步骤摘要】
一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法(一)
本专利技术涉及一种水体有机污染物的去除方法，特别涉及一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。(二)
技术介绍
水蕹菜(IpomoeaaquaticaForsk)属旋花科草本植物，俗称竹叶菜，有水生和旱生两种生态类型。水蕹菜可以一次栽种、多次收割，从而把营养物质直接从污染水体中去除而不产生二次污染。有学者研究了水蕹菜在水体净化方面的功能。李欲如等在苏州重污染河道上种植水蕹菜以控制水体水质污染。不仅进行了静态试验，而且在重污染河道苗家河上作了示范应用。静态试验结果表明在气温35℃、水温30℃以上的条件下，水蕹菜对重污染水体中利用高锰酸盐指数法测定的化学需养量浓度(CODMn)、总氮浓度(TN)、NH4+-N、总磷浓度(TP)的去除率分别为37.0％、92.9％、93.9％、94.3％；苗家河示范工程水域中水质有明显改善，透明度可达90-130cm，认为水蕹菜是对苏州重污染河道净化处理的优良生物材料之一(李欲如,操家顺,徐峰,周金余.水蕹菜对苏州重污染水体净化功能的研究.环境污染与防治,2006,28(1):69-71)。操家顺等报道了水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能，结果与李欲如等的报道相似(操家顺,李欲如,陈娟.水蕹菜对重污染河道净化及克藻功能.水资源保护,2006,22(2):36-41)。顾国平等采用浮床种植水蕹菜等6种陆生植物，初步研究了浮床种植植物对景观水体中主要养分氮、磷的去除动态及效率，结果表明，以水蕹菜去除效果最佳。水蕹菜能够大量吸收N、P营养提供自身生长所需，在试验进行的第6d及第10d可分别使试验水体的TN、TP去除率达到100％，对改善水质、修复水体具有重要作用(顾国平,周丽燕,王森.空心菜对景观水中氮磷的去除效果研究初报.安徽农学通报,2008,14(19):111-112)。黄婧等研究了浮床水培水蕹菜的生物学特性及水质净化效果，结果显示，水蕹菜以总氮计，1m2的水蕹菜可以把73.06m3的水由Ⅴ类净化到Ⅲ类；以总磷计，则可净化134.73m3的水，因此，水蕹菜与其他水培植物相比具有较强的N、P吸收力，是一种可用于富营养化水体水质净化的优良植物(黄婧,林惠凤,朱联东,李兆华.浮床水培蕹菜的生物学特征及水质净化效果.环境科学与管理,2008,33(12):92-94)。宋超等利用PVC管构建浮床，研究了浮床栽培水蕹菜对罗非鱼养殖池塘水体中N和P的控制效果。数据表明，在试验后期，池塘水体中总氮水平降至淡水养殖池塘废水排放二级标准，而总磷水平达到地表水环境质量二类标准，氨氮的水平控制在1mg/L以下，而亚硝酸盐氮水平则控制在0.1mg/L以下。从各处理组对污染物的去除情况来看，水蕹菜种植时间与种植面积均与N、P的去除效果呈现较好的正相关关系，种植时间越长(>60天)，种植面积与去除效果的正相关性越明显。结果表明，在集约化养殖池塘中采用浮床栽培水蕹菜能够对氮和磷实现有效的控制，并且，水蕹菜浮床覆盖率为20％时比10％和15％处理组更具有经济效益(宋超,陈家长,戈贤平,吴伟,范立民,孟顺龙,胡庚东.浮床栽培空心菜对罗非鱼养殖池塘水体中氮和磷的控制.中国农学通报,2011,27(23):70-75)。唐莹莹等报道在塑料水箱中水培水蕹菜，研究浮床水蕹菜对氮循环细菌数量、分布和氮素净化效果的影响。研究结果表明，浮床水蕹菜氮循环细菌总数、氨化菌、亚硝化菌、硝化菌数量极显著高于空白对照；而浮床水蕹菜反硝化菌数量与空白对照差异不显著；氨化菌在根内、根面、水体中的分布差异不大，亚硝化菌主要分布在根内和根面，硝化菌主要分布在根面，反硝化菌主要分布在水体中。试验结束时，浮床水蕹菜系统和空白对照对氨氮的去除率分别为91.8％和88.5％。浮床水蕹菜系统中氮素的去除是植物吸收、根系表面的氨化作用、以及水体中硝化和反硝化共同作用的结果，而空白对照系统中氮素的主要去除途径是微生物的硝化和反硝化作用以及氨挥发(唐莹莹,李秀珍,周元清,贾悦,辛在军,孙永光.浮床空心菜对氮循环细菌数量与分布和氮素净化效果的影响.生态学报,2012,32(9):2837-284)。杨文婕和刘更另分析了磷和硫对水蕹菜吸收砷的影响，结果显示，微量的砷有利于水蕹菜生长，而过量的磷和硫阻抑砷这种有益效应的发挥(杨文婕,刘更另.磷和硫对空心菜吸收砷的影响.环境化学,1995,15(4):374-379)。此外，任朋娟等研究两性表面活性剂BS-12和Cd2+共存对水蕹菜种子萌发、叶绿素含量及MDA含量等的影响。结果表明，BS-12为50mg/L时，能降低Cd2+对水蕹菜种子萌发的毒害作用(任朋娟,孟昭福,马云飞,袁进,郭彩虹,樊利,赵贤.BS-12与Cd2+复合污染对空心菜种子萌发及生长的影响.西北农业学报,2011,20(4):129-133)。上述有关水蕹菜的修复作用仅限于对N、P和重金属的污染修复，未见其具有修复有机污染物的研究报道。细胞色素P450酶是一类与重金属结合的血红蛋白，在代谢异源有机物方面起着重要作用；其中，P450酶家族成员之一P4502E1(CYP2E1，其编码基因简称为cyp2e1)，主要分布在哺乳动物肝细胞中，对有机污染物具有非常重要的解毒功能(LeeSS,ButersJT,PineauT,Fernandez-SalgueroP,GonzalezFJ.RoleofCYP2E1inthehepatotoxicityofacetaminophen.JBiolChem,1996,271(20):12063-12067)。为此，本专利技术利用发根农杆菌转基因技术将cyp2e1基因转入水蕹菜中，有效提高水蕹菜对有机污染的修复能力，进一步提高水蕹菜对水体复合污染的综合修复能力。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，所述方法包括：(1)无菌苗的培养：将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0.5-2.0mg/L6-BA+0.25mg/LIAA的MS培养基上，22±2℃，光照培养，获得无菌苗；(2)侵染菌液：将含有核苷酸序列为SEQIDNO:1所示cyp2e1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含Km50mg/L+Str50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600为0.4-0.6，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮清洗3次，离心去除清洗液，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液(重复清洗3次)后，沉淀再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0.1-0.2菌悬液，作为侵染菌液；(3)转基因植株的获取：将步骤(1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至株高5.5-6cm时在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤(2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2℃，光照培养，获得转基因毛状不定根；(4)转基因植株：当步骤(3)获得的毛状不定根长达5-6cm时，将着生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法包括：(1)无菌苗的培养：将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0.5～2.0mg/L 6‑BA+0.25mg/L IAA的MS培养基上，22±2℃，光照培养，获得无菌苗；(2)侵染菌液：将含有核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示cyp2e1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含Km 50mg/L+Str 50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600为0.4‑0.6，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液后再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0.1‑0.2菌悬液，作为侵染菌液；(3)转基因植株的获取：将步骤(1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至株高5.5‑6cm时在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤(2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2℃，光照培养，在伤口处获得转基因毛状不定根；(4)转基因复合型植株：当步骤(3)获得的毛状不定根长达5‑6cm时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎，然后将着生有毛状不定根的茎直接插入含质量浓度0.6％琼脂的1/2MS(0)的培养基中，22±2℃，光照培养10‑15天，然后打开瓶盖练苗2‑3天，取出洗去根部的琼脂，转移至1/2MS液体培养基中生长，即获得转基因复合型水蕹菜植株。...
【技术特征摘要】
1.一种清除水体有机污染物的转基因复合型水蕹菜的培育方法，其特征在于所述方法包括：(1)无菌苗的培养：将水蕹菜种子消毒后接种在1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至萌发小苗，剪取靠顶端的带叶茎段作为外植体，然后将外植体转入含0.5～2.0mg/L6-BA+0.25mg/LIAA的MS培养基上，22±2℃，光照培养，获得无菌苗；(2)侵染菌液：将含有核苷酸序列为SEQIDNO:1所示cyp2e1基因的质粒导入发根农杆菌，筛选得到抗性菌落；将抗性菌落活化后接种至含Km50mg/L+Str50mg/L的LB液体培养基中，28℃，200r/min培养至OD600为0.4-0.6，离心，沉淀用MS液体培养基悬浮，离心去除清洗液后再用MS液体培养基悬浮，制成光密度OD值为0.1-0.2菌悬液，作为侵染菌液；(3)转基因植株的获取：将步骤(1)培育的无菌苗转入1/2MS(0)培养基上，22±2℃，光照培养至株高5.5-6cm时在植株的茎上刺出伤口，然后将步骤(2)制备的侵染菌液滴加在植株的伤口处，22±2℃，光照培养，在伤口处获得转基因毛状不定根；(4)转基因复合型植株：当步骤(3)获得的毛状不定根长达5-6cm时，将着生有毛状不定根的茎与原植株分离剪断并保留完整的毛状不定根的茎，然后将着生有毛状不定根的茎直接插入含质量浓度0.6％琼脂的1/2MS(0)的培养基中，22±2℃，光照培养10...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙扬，向太和，韩依萱，王嫚，宋亚玲，吴玲，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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