重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)优化重组α-银环蛇毒素(αBtx)的编码序列，优化后的编码序列如SEQ ID NO.15所示；(2)以SEQ ID NO.15所示编码序列为基础，构建重组α-银环蛇毒素(rαBtx)的表达载体；(3)将表达载体转化大肠杆菌，构建αBtx重组表达工程菌，培养rαBtx重组表达工程菌后，以IPTG诱导rαBtx表达。

【技术实现步骤摘要】
重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法。
技术介绍
α-银环蛇毒素(α-Βungarotoxin,αBtx)是银环蛇(BungarusMulticinctus)毒液中的重要成分，由73个氨基酸组成的蛋白质，分子量为8kDa。αBtx可特异性结合并阻断哺乳动物神经肌接头处的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)，使神经-肌肉电化学偶联脱偶联，导致骨骼肌无法收缩。αBtx对nAChR有非常高的亲和力和特异性，是研究nAChR的理想工具。以往使用的αBtx均从银环蛇的毒液中提取，过程复杂、成本昂贵，加之银环蛇产毒量底，因此商品化的αBtx非常昂贵。寻找并建立一个体外大量获得αBtx的方法和途径是国内外许多实验室竞相努力的目标。由于αBtx合成加工的特殊性，由5对分子内二硫键交联组成的特点，以及原核表达体系与蛇毒腺细胞的mRNA密码子的偏爱性的不同，缺乏对真核基因翻译后的折叠伴侣，使以αBtx全序列cDNA作原核表达无法得到表达产物，或即便得到了表达产物，也不具有野生αBtx的活性。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法包括如下步骤：(1)优化重组α-银环蛇毒素αBtx的编码序列，优化后的编码序列如SEQIDNO.15所示，命名为BtxV31；(2)以SEQIDNO.15所示编码序列为基础，构建重组α-银环蛇毒素αBtx的表达载体；(3)将表达载体转化大肠杆菌，构建αBtx重组表达工程菌，培养αBtx重组表达工程菌后，以IPTG诱导αBtx表达。其中，所述步骤(2)是构建含有序列如SEQIDNO.1至4所示的表达载体；含SEQIDNO.1所示序列的表达载体命名BtxNdB，含SEQIDNO.2所示序列的表达载体命名为BtxNdB2，含SEQIDNO.3所示序列的表达载体命名为BtxNcB，含SEQIDNO.4所示序列的表达载体命名为BtxNcB2；然后以BtxNcB和BtxNcB2为基础，构建含序列SEQIDNO.5和6所示的表达载体，含SEQIDNO.5所示序列的表达载体命名为BtxT60NcB，含SEQIDNO.6所示序列的表达载体命名为表达载体BtxT60NcB2；再以BtxT60NcB和BtxT60NcB2为基础，构建含序列SEQIDNO.7至14所示的表达载体，含SEQIDNO.7所示序列的表达载体命名为BtxS5NcB，含SEQIDNO.8所示序列的表达载体命名为BtxS5NcB2，含SEQIDNO.9所示序列的表达载体命名为BtxS7NcB，含SEQIDNO.10所示序列的表达载体命名为BtxS7NcB2，含SEQIDNO.11所示序列的表达载体命名为BtxS11NcB，含SEQIDNO.12所示序列的表达载体命名为BtxS11NcB2，含SEQIDNO.13所示序列的表达载体命名为BtxS12NcB，含SEQIDNO.14所示序列的表达载体命名为BtxS12NcB2。步骤(3)是将表达载体BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB、BtxNcB2、BtxT60NcB、BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、BtxS7NcB、BtxS7NcB2、BtxS11NcB、BtxS11NcB2、BtxS12NcB或BtxS12NcB2转化大肠杆菌BL21(DE3)，平板培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)，挑取平板上长出的转化菌落在IPTG条件下诱导培养，诱导αBtx的表达。在步骤(3)诱导αBtx表达后，将诱导培养后的菌液离心，将离心后的菌体裂解后再离心，得到粗包涵体；将粗包涵体溶解后过QSepharoseFF柱，以Bradford法确定αBtx峰所在组分，合并含有αBtx的组分用于复性，最后将复性后的αBtx纯化。上述方法中，构建重组α-银环蛇毒素αBtx的表达载体所用引物为SEQIDNO.17—23所示的引物。本专利技术还提供了构建上述方法中重组α-银环蛇毒素αBtx的表达载体的试剂盒，所述试剂盒中包括SEQIDNO.17—23所示的引物。下面对本专利技术作进一步说明：本专利技术将基因工程和蛋白质工程技术相结合，通过将αBtx的基因编码序列按照大肠杆菌偏爱密码子重新优化合成，并通过mRNA二级结构的分析，进一步对编码序列进行优化突变，最终得到非融合表达方式的重组α-银环蛇毒素αBtx。然后，利用蛋白质复性技术，制备有天然活性的重组αBtx蛋白。具体来说，本专利技术按照重组α-银环蛇毒素αBtx成熟肽的氨基酸序列，然后按照大肠杆菌偏爱密码子合成编码此氨基酸序列的DNA序列BtxV31(SEQIDNO.15)，然后按常规方法将该序列与市售的克隆载体(如pUC57等)构建成含有该序列的载体(如BtxV31-pUC57)，然后以Btx16bNcoI(SEQIDNO.17)与Btx16bBamHI2(SEQIDNO.19)为引物构建表达载体BtxNdB和BtxNdB2，以Btx16bNcoI(SEQIDNO.17)与Btx16bBamHI(SEQIDNO.18)为引物构建表达载体BtxNcB和BtxNcB2；这四个表达载体区别是，BtxNcB2编码的是核心序列，其余的三个序列分别在其N末端，C末端加入了融合标签，用于提高表达产量，BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB和BtxNcB2的序列依次如SEQIDNO.1—4所示。再分别以BtxNcB和BtxNcB2为基础，以Btx16b167Tu(SEQIDNO.20)和Btx16b167Td(SEQIDNO.21)为引物构建表达载体BtxT60NcB和BtxT60NcB2，进而分别以前二者为模板，分别以Btx16S5m(SEQIDNO.22)，Btx16S7m(SEQIDNO.23)为上游引物，以Btx16bBamHI(SEQIDNO.18)为下游引物，构建表达载体BtxS5NcB、BtxS7NcB、BtxS11NcB和BtxS12NcB，以Btx16bBamHI2(SEQIDNO.19)为下游引物则构建表达载体BtxS5NcB2、BtxS7NcB2、BtxS11NcB2和BtxS12NcB2；BtxT60NcB、BtxT60NcB2、BtxS5NcB、BtxS5NcB2、BtxS7NcB、BtxS7NcB2、BtxS11NcB、BtxS11NcB2、BtxS12NcB和BtxS12NcB2的序列如SEQIDNO.5—14所示；这几个序列都是编码能够表达相同的αBtx的基因序列，每一个载体都能够单独起做用，区别是编码序列稍有不同。然后以以上表达载体转化BL21(DE3)宿主菌，以IPTG诱导表达、分离rαBtx蛋白质，并对得到的包涵体纯化、复性，纯化活性蛋白，最终得到具有生物学活性的重组α-银环蛇毒素(rαBtx)。所述的含有按照大肠杆菌偏爱密码子优化合成的编码αBtx成熟肽的DNA序列的表达载体BtxNdB、BtxNdB2、BtxNcB、BtxNcB2，是含有与上述αBtx编码DNA90％以上的同源性的DNA序列的表达载体，当然，构建表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组α‑银环蛇毒素αBtx的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)优化重组α‑银环蛇毒素αBtx的编码序列，优化后的编码序列如SEQ ID NO.15所示；(2)以SEQ ID NO.15所示编码序列为基础，构建重组α‑银环蛇毒素(rαBtx)的表达载体；(3)将表达载体转化大肠杆菌，构建rαBtx重组表达工程菌，培养rαBtx重组表达工程菌后，以IPTG诱导rαBtx表达。

【技术特征摘要】
1.重组α-银环蛇毒素αBtx的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)优化重组α-银环蛇毒素αBtx的编码序列,优化后的编码序列如SEQIDNO.15所示;(2)以SEQIDNO.15所示编码序列为基础,构建重组α-银环蛇毒素αBtx的表达载体;具体步骤为：构建含有序列如SEQIDNO.1至4所示的表达载体;将含有SEQIDNO.1所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNdB,将含有SEQIDNO.2所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNdB2,将含有SEQIDNO.3所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNcB,将含有SEQIDNO.4所示序列的表达载体命名为表达载体BtxNcB2;然后以表达载体BtxNcB和BtxNcB2为基础,构建含有序列如SEQIDNO.5和6所示的表达载体,将含有SEQIDNO.5所示序列的表达载体命名为表达载体BtxT60NcB,将含有SEQIDNO.6所示序列的表达载体命名为表达载体BtxT60NcB2;再以表达载体BtxT60NcB和BtxT60NcB2为基础,构建含有序列如SEQIDNO.7至14所示的表达载体，将含有SEQIDNO.7所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS5NcB,将含有SEQIDNO.8所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS5NcB2,将含有SEQIDNO.9所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS7NcB,将含有SEQIDNO.10所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS7NcB2,将含有SEQIDNO.11所示序列的表达载体命名为表达载体BtxS11NcB,将含有SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐江，陈永恒，陈主初，陈林，李柱一，徐志凯，吴兴安，李佳，李俊，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：湖南;43