一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂及其制备方法，属于再生医学和组织工程领域。本发明专利技术贴剂使用电纺生物膜联合间充质干细胞构建，不仅可以将间充质干细胞移植到皮肤破溃处，促进间充质干细胞的粘附、增殖，而且电纺生物膜能保护细胞生长，促进间充质干细胞微观结构及形貌的形成，促进皮肤创伤的愈合，为提高间充质干细胞的移植功效提供了新的思路。本发明专利技术公开的制备方法，取材方便，制作简单。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂及其制备方法，属于再生医学和组织工程领域。本专利技术贴剂使用电纺生物膜联合间充质干细胞构建，不仅可以将间充质干细胞移植到皮肤破溃处，促进间充质干细胞的粘附、增殖，而且电纺生物膜能保护细胞生长，促进间充质干细胞微观结构及形貌的形成，促进皮肤创伤的愈合，为提高间充质干细胞的移植功效提供了新的思路。本专利技术公开的制备方法，取材方便，制作简单。【专利说明】
本专利技术属于再生医学和组织工程领域，具体涉及一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂及其制备方法。
技术介绍
各种重症皮肤破溃性疾病及烧伤、烫伤是生活中常见的意外伤害。鳞状细胞癌是一种常见的恶性皮肤肿瘤，早期即可呈溃疡状，又常继发于慢性溃疡或慢性窦道开口，或瘢痕部的溃疡经久不愈造成局部扩散和远地转移，所以应及早进行有效的临床治疗。沸水、热油、热蒸气的烧烫是常会发生的事，特别是大面积损伤侵及真皮层，可能造成经久不愈；即使愈合也会留下瘢痕挛缩，造成功能障碍；如果处理不当，还会引起感染甚至威胁生命。 而目前临床上所用创面敷料大致分为三类:天然材料类、动物组织衍生物制品和合成高分子材料类，然而天然材料类敷料及动物组织衍生制敷料都有不同程度的来源不足、不易储存等缺点，为了提供组织愈合良好的生长环境，构建具有类似天然细胞外基质结构和功能的生物材料支架，为细胞提供理想的体外体内生长环境是组织工程的研究热点，即仿生型纳米支架的构建。在仿生型纳米支架的构建中，静电纺织技术已经广泛用于各种组织的重建中。研究表明，利用静电纺织技术可以得到可用于组织重建的理想材料。相对于微米尺度，纳米尺度的纤维有序排列和拓扑结构与机体内细胞生长的自然环境更为相似，同时，纳米纤维的排列可以决定细胞分泌的外基质和细胞骨架的取向，进而影响新生组织的机械强度及功能。合成高分子材料中的组织工程敷料一 PCL(polycaprolactone)-明胶电纺纤维膜，作为一种高分子材料构建的三维多孔仿生支架，不仅具备优越的机械性能且具有一定的生物学活性，是新一代的人工敷料。该电纺生物膜具有高孔隙率和高比表面积，还可以作为生长因子的载体将药物在伤口处释放以达到保护创面促进愈合的目的。间充质干细胞在PCL-胶原复合膜上能完成吸附并有较快的生长速度，PCL-胶原复合膜对间充质干细胞的生长没有影响，细胞与膜经过长时间培养，生长稳定。PCL-胶原复合膜有很好的细胞相容性，细胞吸附增殖良好，能刺激细胞外基质分泌，是用于皮肤等组织修复的良好材料。 间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，随着干细胞工程与组织学工程的进展，间充质干细胞实际应用研究日益受到重视，特别是其多向分化的潜能，显示了在创伤修复领域诱人的应用前景。大量的研究已经表明，间充质干细胞具有明显地促进皮肤生长，加快伤口愈合的功能。间充质干细胞可以分化成角质形成细胞、内皮细胞和周细胞，从而直接参与伤口的愈合和结构的重塑。这些细胞还可以通过旁分泌一系列的细胞因子、炎症趋化因子以及生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等来促进伤口愈合和调节免疫系统。这些因子可以诱导内皮细胞及血管平滑肌细胞的聚集、增殖和血管化。但间充质干细胞直接移植到伤口表面存活时间相对有限，在与环境接触后易发生凋亡、生长错位且极难维持细胞的极性。本专利技术研制的这种将干细胞制剂联合生物膜就可以解决间充质干细胞直接移植产生的生存时间问题，因而可广泛应用于治疗各种重症皮肤破溃性疾病中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂及其制备方法。本专利技术干细胞贴剂利用电纺生物膜构建，不仅可以将间充质干细胞移植到皮肤破溃处，促进间充质干细胞的粘附、增殖，不引起炎症反应，而且能保护细胞生长，促进间充质干细胞微观结构及形貌的形成，促进皮肤创伤的愈合，为提高间充质干细胞的移植功效提供了新的思路。 为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现:一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂，是由附着生长有间充质干细胞的一种高分子电纺纤维生物膜构建组成。 进一步的，所述的一种高分子电纺纤维生物膜是一种以高压静电纺织技术得到的类似细胞外基质纳米结构的单纯高分子聚乙内酯多元醇(PCL)-胶原复合膜。 ，其特征是由下述步骤组成:(1)PCL-胶原复合膜的制备；(2)间充质干细胞的制备；(3)PCL-胶原复合膜的预处理；(4)生物膜细胞贴剂的构建。 进一步的，所述步骤(I)中PCL-胶原复合膜的制备包括以下步骤:第一步，配制静电纺丝溶液:称取0.50gPCL颗粒，溶解于4ml氯仿中；另称取0.025g胶原，溶解于Iml六氟异丙醇中(HFIP)中，各自用磁力搅拌子搅拌过夜(大于12h)，将溶解好的两种溶液进行混合，用磁力搅拌子搅拌12h以上，得到静电纺丝溶液。 第二步，静电纺丝过程:将静电纺丝溶液装入注射器中，注射器配置直径0.6mm的钝性转头，在电压10kv，收集距离即喷头与接受盘之间的距离为15cm，液流速度为0.75ml/h的条件下电纺。 第三步，后期处理:电纺完成后，将静电纺丝膜在通风橱中2?3小时，待残余有机溶剂完全挥发，即可得到单纯高分子聚乙内酯多元醇(PCL)-胶原复合膜。 进一步的，所述步骤(2)中间充质干细胞制剂的制备方法为:收集体外扩增培养的间充质干细胞，制备浓度为40 X 16个/ml?60 X 16个/ml的干细胞悬液，并通过流式细胞仪筛选表达⑶105、⑶90、⑶73和⑶29，不表达⑶34和⑶14的间充质干细胞。 进一步的:所述步骤(3)中PCL-胶原复合膜的预处理方法为:在细胞接种前，将单纯高分子聚乙内酯多元醇(PCL)-胶原复合膜置入适宜大小的培养皿中，用3M的NaOH于37°C浸泡2h，PBS缓冲液浸泡10次，每次15分钟。 进一步的:所述步骤(4)干细胞贴剂的构建方法为:将步骤(2)制备的间充质干细胞悬液均匀地接种在步骤(3)预处理好的PCL-胶原复合膜上，细胞接种密度为8000/cm2，使其吸附2小时后加入培养基，每2天换液一次，构建7天后即为生物膜细胞贴剂，构建成功的生物膜细胞贴剂在移植前添加重组人表皮生长因子lOOOIU/cm2。 本专利技术相对于现有技术具有以下优点和效果: 1.本专利技术公开了一种治疗烧伤、烫伤、鳞状细胞癌早期溃疡等重症皮肤破溃性疾病的干细胞贴剂的制备及使用方法，不仅可以治疗大面积严重烧伤、烫伤、鳞状细胞癌早期溃疡，还能治疗其它各种原因引起的外伤、褥疮、无名肿毒、疖肿、皮肤溃疡等。利用高分子电纺生物膜构建的干细胞贴剂敷于患处，具有明显的优势:a)干细胞具有归巢性和迁徙效应，可使干细胞及时到达受损和病变的皮肤和皮下组织行使功能山)干细胞能产生细胞因子、生物因子、NK自然杀伤细胞等，直接作用于患处，使细胞迅速得到修复和替换受损的组织；c)同时可重塑血液系统和免疫系统的功能；d)可有效的修复破溃皮肤并修复瘢痕。e)这种电纺生物膜对皮肤组织有较高的亲和性，特别是大面积损伤时，与干细胞联合构建的干细胞贴剂可替代皮肤移植。f)这种电纺生物膜能使破溃处移植的干细胞存活时间延长，给干细胞提本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗重症皮肤疾病和损伤的干细胞贴剂，其特征在于：是由附着生长有间充质干细胞的一种高分子电纺纤维生物膜构建组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周萱，
申请(专利权)人：奥思达干细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32