本发明专利技术公开了一种用于β-HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其选用抗β-HCG单克隆抗体作为包被抗体，用碳酸钠缓冲溶液稀释至1－10ug/ml作为包被液；配对抗β-HCG单克隆抗体用镧系元素离子标记作为标记抗体；实验时用反应缓冲液按1∶20稀释使用；在包被抗体的反应板上，每孔依次加入25ul的β-HCG的标准品或待测样品、以及稀释的标记抗体，孵育后进行荧光检测。本发明专利技术还提供相应的试剂盒。本发明专利技术具有较高的灵敏度、特异性及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
【技术实现步骤摘要】
—种用于β _HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂合Si
本专利技术涉及一种用于β -HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，属于时间分辨免疫荧光分析法检测领域。
技术介绍
人绒毛膜促性腺激素(HCG)在人体内以多种形式存在，其中游离β亚基是HCG在新陈代谢过程中β亚基的44-45位置肽连接处断开所形成，是一种应用于产前筛查的血清标志物。妊娠期母血清中β-HCG水平呈双峰曲线，第I峰于妊娠12周前后，15周后出现生理性下降，20?32周维持低而平稳水平，26周达最低。第2峰于妊娠37周，明显低于第I峰，至妊娠足月时稍有下降。在妊娠11周内，血清β-HCG的含量与孕龄密切相关，随妊娠进展呈直线上升，孕龄每增加I天，β -HCG平均增加1.53IU/ml，分娩后急剧下降，产后4天降至lIU/ml，产后9天基本消失。1987年Bargot发现怀有唐氏综合症(DS)胎儿的孕妇血清中的hCG的水平是正常孕妇的2倍。以孕妇年龄再结合血清中hCG等指标检测，DS的筛查率可达到63%。1988年，伦敦Bartholomews医院Wald提出AFP、β _HCG、uE3三联的筛查方法，得到广泛应用，一直用到至今。胎儿患唐氏综合症时，胎盘重量低于正常水平，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，因此孕妇血清中hCG浓度下降要比怀正常胎儿的孕妇晚3周左右，致使孕中期(约20周左右)母血清中的hCG浓度呈高水平状态，怀唐氏综合症儿孕妇血清中β-HCG浓度比正常孕妇至少高2倍(一般> 2.5Μ0Μ)。因此，孕妇血清中β -HCG浓度可以作为筛选孕妇所怀胎儿是否患有唐氏综合症的一个辅助指标。目前血清的β-HCG检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，此外还有一定的放射性污染。时间分辨免疫荧光分析(time-resolvedf luoroimmunoassay, TRFIA)利用具有独特突光特性的镧系元素,代替酶、同位素等,做为发光免疫分析中的一种重要方法，具有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染等许多优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于β -HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。本专利技术采用铕标记技术，提供铕标记试剂盒，以提高方法的灵敏度及稳定性。本专利技术的技术方案是:在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完β -HCG成下列准备工作: 首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗体包被的板，β -HCG包被板条的制备包括以下步骤: (1)将纯化的B-HCG单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得β-HCG单克隆抗体包被板条； (2)将β-HCG单克隆抗体包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是β -HCG铕标记的制备，包括以下步骤: (1)取待标记抗体加入透析袋中，放入配制好的PH9.5的碳酸盐缓冲液中，室温透析过夜(其间多次换透析液)； (2)次日，取出抗体，稀释至0.2-5 ug/mL，按质量比为2: I的比例(DTTA-Eu:抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振荡过夜，然后在黑暗中静置48小时； (3)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过SephadexG50色谱柱(I X 30cm)分离,分离过程用核酸蛋白仪监控；分离所用洗脱液为PH7.8 50mmol/L Tris-HCl缓冲液。(4)用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在280nm处测吸光度，同时测荧光强度，计算出Eu标抗体浓度； (5)用0.22um的滤器过滤； (6)加入0.5% BSA，2-8°C保存。β -HCG时间分辨免疫荧光分析法，包括下列步骤: ①固相抗体制备:将抗β-HCG单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至l-10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭； ②镧系元素离子标记抗体制备:选用配对抗β-HCG单克隆抗体用镧系元素离子标记； ③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入β-HCG标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为l-10ug/mL，步骤②中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1: 20稀释。步骤②中的镧系元素离子优选为Eu3+。步骤③中的反应缓冲液为 PH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl,内含 0.9% NaCl, I % BSA, 0.05%牛 IgG，20uM DTPA,0.08% Tween20和0.1% NaN3 ;且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。所用增强液为荧光增强液。β -HCG定量检测试剂盒,其特征是试剂盒包括:包被抗体的缓冲液、封闭液、反应缓冲液、洗液、增强液，以及作为包被抗体的抗β -HCG单克隆抗体，镧系元素离子标记的抗β -HCG单克隆抗体和β -HCG标准品。所述β -HCG标准品的制备方法为:先分别将β -HCG冻干抗原溶解并稀释至所需的最高浓度，再采用倍比稀释法稀释至所需浓度，获得β -HCG标准品。标准品为用含6% BSA，4%蔗糖，0.1% NaN3, 50mmol/L Tris-HCl缓冲液将泌乳素蛋白配制成标准品。本专利技术的有益效果是:本专利技术使用双抗体夹心法，反应步骤包括:试剂准备、加样反应、洗涤拍干、加增强液、测荧光值，分析灵敏度高(0.3 IU/L)，检测时间短，特异性好，与干扰物质的交叉反应小。【附图说明】: 图1为本专利技术的反应原理图 本专利技术采用双抗体夹心一步法。抗人β-HCG单抗包被于96孔荧免板，校准品或样品中的β-HCG与包被单抗及铕离子(Eu3+)标记的单抗于微孔内表面发生免疫反应，微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记单抗通过洗涤分离。微孔表面免疫复合物中的Eu3+被荧光增强液解离后形成稳定的荧光配合物，荧光强度与校准品或样品中的β -HCG浓度呈正比例，通过剂量-反应曲线可得出样品中β-HCG浓度。【具体实施方式】: 下面参照图1通过实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1:进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完β -HCG成下列准备工作: 首先制备包被板，所用的包被板为特异性抗体包被的板，β -HCG包被板条的制备包括以下步骤: (1)将纯化的β-HCG单克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得β -HCG单克隆抗体包被板条； (2)将β-HCG单克隆抗体包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是β -HCG铕标记的制备，包括以下步骤: (1)取待标记抗体加入透析袋中，放入配制好的pH9.5的碳酸盐缓冲液中，室温透析过夜(其间多次换透析液)； (2)次日，取出抗体，稀释至0.2-5ug/mL，按质量比为2: I的比例(DTTA-Eu:抗体)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振荡过夜，然后在黑暗中静置48小时； (3)标记好的抗体与游离DTTA-Eu通过Sephad本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于β‑HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其特征是：所述分析法包括下列步骤：①固相抗体制备：将抗β人绒毛膜促性腺激素（β‑HCG）单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1‑10ug/mL作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备：选用配对抗β‑HCG单克隆抗体用镧系元素离子标记；③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入β‑HCG标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。
【技术特征摘要】
1.一种用于β-HCG检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其特征是:所述分析法包括下列步骤: ①固相抗体制备:将抗β人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)单克隆抗体用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-lOug/mL 作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭； ②镧系元素离子标记抗体制备:选用配对抗β-HCG单克隆抗体用镧系元素离子标记； ③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入β-HCG标准品或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗体进行孵育，最后进行荧光测定。2.根据权利要求1所述β-HCG时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中的镧系元素离子为Eu3+。3.根据权利要求1所述β-HCG时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤③中的反应缓冲液为 PH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl,内含 0.9% NaCl, I % BSA, 0.05%牛 IgG，200uM DTPA,0.05% Tween20和0.1% NaN3 ;且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。4.如权利要求1所述的β-HCG时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中镧系元素离子标记抗体制备是采用如下方法进行: (1)取待标记抗体加入透析袋中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永锋，陈国勇，傅汝毅，陶玲云，蓝文苑，
申请(专利权)人：广西博士海意信息科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45
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