一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法技术

一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，属于生物农药技术领域。其特征在于包括以下步骤：1）称取喜树碱原药、氢氧化钠、水配制喜树碱溶液；2）将喜树碱溶液稀释处理昆虫，最后365-430nm波长下置于荧光显微镜下观察喜树碱的沉积部位，然后将该部位的大量细胞置于冰箱中冷冻，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理，使其释出蛋白质等细胞液，再将细胞液离心、过滤，保留上清液；3）将上清液通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈－水溶剂系统梯度洗脱，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。该喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，可快速、准确测定生物碱类在细胞中的沉积部位，精确度高，稳定性好。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，属于生物农药
。其特征在于包括以下步骤：1）称取喜树碱原药、氢氧化钠、水配制喜树碱溶液；2）将喜树碱溶液稀释处理昆虫，最后365-430nm波长下置于荧光显微镜下观察喜树碱的沉积部位，然后将该部位的大量细胞置于冰箱中冷冻，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理，使其释出蛋白质等细胞液，再将细胞液离心、过滤，保留上清液；3）将上清液通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈－水溶剂系统梯度洗脱，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。该喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，可快速、准确测定生物碱类在细胞中的沉积部位，精确度高，稳定性好。【专利说明】
本专利技术属于生物农药工程
，具体为。
技术介绍
植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种，其中的大多数化学物质如萜烯类、生物碱、类黄酮、留体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫活性。喜树(Camptothecia acuminata Decaisne)别名:旱莲木、水桐树，是我国特有树种，分布于浙江、福建、江西、四川、云南等省区，在四川西部成都平原和江西东南部均较常见，属山茱萸目珙桐科。其所含有抗肿瘤作用的生物碱-喜树碱(CPT)分子式SC2OH16N2O4,相对分子质量348.34，具有抗癌、清热杀虫的功能。喜树碱没有明显的碱性，属于中性生物碱，不溶于酸，与酸不易成盐，所以不能用生物碱常规的提取方法分离。研究发现CPT能够阻断拓朴异构酶I的合成，CPT阻断这种酶的产生即可阻止癌细胞的生长，临床研究表明，CPT对各种移植的动物肿瘤及移植于裸鼠身上的胃癌和大肠癌均有显著疗效。目前张立钦等研究发现CPT对蚜虫、小绿叶蝉、水稻二化螟和稻飞虱等均具有较高的杀虫活性。但是由于化合物的不同光学异构体在生物活性和作用靶点上都有可能不同。早期的研究表明喜树碱作为一种拓朴异构酶I抑制剂，能够阻断这种酶的产生，同时抑制肿瘤细胞的正常运转，而关于植物源农药其在害虫体内如何发挥杀虫活性的作用机理却未见相关报道。张立钦等前期室内研究发现喜树碱可以干扰试虫的正常生长发育，田间试验过程中亦观察到喜树碱药剂可使害虫出现摇头、麻痹、最终死亡的现象。本专利技术可以精准定位出喜树碱作用的虫体细胞靶蛋白，从而为研究生物农药对害虫的致毒机理提供了可能，通过精准定位生物碱作用的具体部位，可为植物源药剂毒理学研究和新药的开发提供理论和技术支持。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的目的在于设计提供的技术方案，以植物体内天然存在的物质喜树碱为研究对象，利用喜树碱的荧光性，构建测定喜树碱与虫体细胞蛋白结合部位的定位方法；其建立的技术可快速、准确测定生物碱类在细胞中的沉积部位，具有精确度高，稳定性好等特点，解决了目前植物源农药活性成分作用机理研究中不能快速找到受体蛋白的问题，可为生物农药的机理研究提供一定参考，为植物源药剂毒理学研究和新药的开发提供理论和技术支持。所述的，其特征在于包括以下步骤: I)按重量百分比称取喜树碱原药0.1-1.5%，氢氧化钠2-9%，水89-98%，反应温度控制在45-65°C下不断搅拌至完全溶解，配制成喜树碱溶液，备用； 2)将步骤I)中的喜树碱溶液稀释至900-1200倍，取1-5 μ L喷雾或饲喂处理昆虫，每隔10-15h处理一次，共处理3-7天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用2-8 μ L浓度为1.2-1.5%的盐酸溶液喷雾或浸溃昆虫2-5min，使其充分浸润，最后365_430nm波长下置于荧光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉积部位，然后将该部位的大量细胞迅速置于_70°C冰箱中冷冻30-50min，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理7-15min，使其充分释出蛋白质等细胞液，再将细胞液9000-12000rpm、2-9°C离心ll_19min,过滤弃沉淀,保留上清液,备用； 3)将处理后的上清液，通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈一水溶剂系统梯度洗脱2-5次，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。所述的喜树碱原药可以由四川锶全天然产物有限公司购得。所述的，其特征在于所述的喜树碱原药含量为0.3-1.2%，优选0.5-1.0%，更优选0.7-0.9%。所述的，其特征在于所述氢氧化钠的含量为4-8%，优选5-6%。所述的，其特征在于水含量为90-95%。所述的，其特征在于步骤I)中:喜树碱水剂配制温度为50-60°C，优选55-58°C。所述的，其特征在于步骤2)中:喜树碱溶液稀释倍数为950-1150倍，优选1000-1100倍；细胞冷冻时间为35_45h，优选38-42h ;离心转速优选10000-1 IOOOrpm,离心温度优选3_7°C,离心时间优选12_17min,波长为 380-400nm。所述的在生物碱与昆虫蛋白作用关系分析及基于喜树碱作用机理研究上的应用。上述，以植物体内天然存在的物质喜树碱为研究对象，利用喜树碱的荧光性，构建测定喜树碱与虫体细胞蛋白结合部位的定位方法；其建立的技术可快速、准确测定生物碱类在细胞中的沉积部位，具有精确度高，稳定性好等特点，解决了目前植物源农药活性成分作用机理研究中不能快速找到受体蛋白的问题，可为生物农药的机理研究提供一定参考，为植物源药剂毒理学研究和新药的开发提供理论和技术支持。具有操作方便，精确度高、快速高效等优点。本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。【专利附图】【附图说明】图1为4个样品的HPLC色谱图； 其中峰序号:1_喜树次碱、2-喜树碱、3-10-羟基喜树碱、4-甲氧基喜树碱； 图2-7分别为实施例1-6喜树碱分子在虫体细胞中的荧光表达。【具体实施方式】以下结合说明书附图对本专利技术作进一步说明。实施例1 在60°C下,将0.1g喜树碱原药,1.45g氢氧化钠,48.45g水投入反应爸中，不断搅拌混合至完全溶解，配制成喜树碱水剂。然后将喜树碱溶液稀释至1000倍，取2.5 μ L喷雾处理昆虫，每隔14h处理一次，共处理3天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用7 μ L质量分数为1.5%的盐酸溶液浸溃昆虫3.5min，使其充分浸润，最后365nm波长下置于荧光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉积部位，然后将该部位的大量细胞迅速置于_70°C冰箱中冷冻38.5h，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理7min，使其充分释出蛋白质等细胞液，再将细胞液10700rpm、7°C离心16min，过滤弃沉淀，保留上清液，最后将处理后的上清液通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈一水溶剂系统梯度洗脱2次，即可。实施例2 在50°C下，将0.45g喜树碱原药，3.8g氢氧化钠，45.75g水投入反应釜中，不断搅拌混合至完全溶解，配制成喜树碱水剂。然后将喜树碱溶液稀释至1100倍，取4 μ L饲喂处理昆虫，每隔13h处理一次，共处理7天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用5μ L质量分数为1.5%的盐酸溶液喷雾昆虫2.5min,使其充分浸润,最后430nm波长下置于突光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种喜树碱作用于虫体细胞靶蛋白的精准定位方法，其特征在于包括以下步骤：1）按重量百分比称取喜树碱原药0.1‑1.5%，氢氧化钠2‑9%，水89‑98%，反应温度控制在45‑65℃下不断搅拌至完全溶解，配制成喜树碱溶液，备用；2）将步骤1）中的喜树碱溶液稀释至900‑1200倍，取1‑5μL喷雾或饲喂处理昆虫，每隔10‑15h处理一次，共处理3‑7天至虫体出现慢性中毒症状直至濒临死亡为止，再用2‑8μL浓度为1.2‑1.5%的盐酸溶液喷雾或浸渍昆虫2‑5min，使其充分浸润，最后365‑430nm波长下置于荧光显微镜下观察，荧光区域即为喜树碱的沉积部位，解剖分离喜树碱沉积部位，然后将该部位的大量细胞迅速置于‑70℃冰箱中冷冻30‑50min，将冷冻后的细胞研磨粉碎，再超声处理7‑15min，使其充分释出蛋白质等细胞液，再将细胞液9000‑12000rpm、2‑9℃离心11‑19min，过滤弃沉淀，保留上清液，备用；3）将处理后的上清液，通过亲和层析法过喜树碱柱子，乙腈－水溶剂系统梯度洗脱2‑5次，即可精准定位出喜树碱与虫体细胞相结合的靶蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张立钦，童森淼，陈安良，胡加付，马建义，王勇军，毛胜凤，刘洪波，张绍勇，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33