本发明专利技术提供一种共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建，以人基因OAT1cDNA为模板，扩增获得人OAT1基因片段，连接到载体pcDNA3.1(+)，获得质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转染MDCK细胞，经筛选得到高表达OAT1的MDCK-hOAT1细胞；然后将人CYP1A2基因片度连接到载体pcDNA3.1/Hygro(+)，获得质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转染MDCK-hOAT1细胞，经潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，再对细胞进行mRNA验证并通过经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明专利技术的细胞模型可在基于OAT1和CYP1A2的药物毒性作用在细胞水平上筛选中的应用，可预测这两种蛋白对药物处置过程中的协同作用，为临床合理用药提供依据。本发明专利技术设计合理，重复性强。
【技术实现步骤摘要】
共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建及应用
本专利技术属生物
，涉及一种共表达摄取转运体OAT1和药物代谢酶CYP1A2细胞模型的构建及应用。技术背景药物进入体内之后往往会经过吸收、分布、代谢、排泄等过程。药物自体外或给药部位经过细胞组成的屏蔽膜进入血液循环，通过门静脉进入肝脏，受到肝脏内药物代谢酶的影响，药物原型或代谢物经过血液循环迅速分布在各组织。肾脏作为人体的重要排泄器官，在药物的处置中发挥重要作用。药物经肾脏的排泄过程包括肾小球滤过、肾小管分泌和重吸收三个过程，其中，转运体会参与肾小管分泌和重吸收过程。肾脏转运体在维持体内稳态中发挥重要作用，是外源物、代谢废物等体内清除的重要途径，是影响食物/药物-药物相互作用的重要因素，影响肾脏疾病的产生等等。人有机阴离子转运体1（hOAT1），是溶质转运体超家族(superfamilyofSolutecarriers，SLC)的成员，主要在近端肾小管上皮细胞基底侧表达，负责将药物或其代谢物从血液摄取到肾小管细胞。OAT1底物谱比较广泛，内源性底物包括环核苷酸、叶酸、前列腺素等，外源性底物包括多种抗病毒药物（阿昔洛韦、西多福韦）、抗生素（青霉素、先锋霉素II）、多种利尿剂（布美他尼、利尿磺胺）以及非甾体类抗炎药、甲氨蝶呤、赫曲霉素A等。作为肾脏中主要的阴离子转运体，OAT1在药物的代谢动力学、药物-药物相互作用以及药物的毒理学中发挥着重要作用。研究表明，同时服用青霉素G和OAT的抑制剂丙磺舒可明显延长前者的半衰期，敲除Oat1的小鼠分泌其经典底物对氨基马尿酸的能力显著降低；OAT1还可介导利尿剂、核酸类似物、抗病毒药物的药物-药物相互作用；OAT可介导β-内酰胺类抗生素和抗病毒药物的肾毒性，而服用OAT的抑制剂丙磺舒可降低西多福韦的潜在毒性，在过表达OAT的细胞系中，西多福韦的细胞毒性有较大升高。OAT1可以介导多种中药成分在肾脏的转运，如黄酮类化合物、酚酸类化合物等。CYP1A2基因定位于人类第15号染色体上，包括7个外显子和6个内含子。CYP1A2是CYP1A家族中重要的药物代谢酶，占整个细胞色素P450的13%-15%，主要分布在肝脏中，另外在肠道，脑，肺中也有少量CYP1A2分布。CYP1A2参与多种药物在体内的生物转化以及一些环境毒素的代谢和致癌物质的激活过程。目前已知CYP1A参与咖啡因、华法林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕尔、硝苯地平、他克林等几十种药物的代谢过程。目前关于药物转运体和代谢酶的协同作用还缺乏全面的了解，可用于该方向研究的体外模型较少。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种共表达摄取转运体和药物代谢酶模型的构建方法，涉及的是共表达人OAT1和CYP1A2细胞模型的构建方法，通过以下步骤实现：（1）先以人基因OAT1cDNA为模板，通过设计含EcoRI和NheI双酶切位点的特定引物SEQIDNo:3和SEQIDNo:4，扩增得到人OAT1基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，经过双酶切的PCR产物和载体pcDNA3.1(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞(ATCC)，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到稳定高表达OAT1的MDCK细胞。（2）然后先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamHI和NheI两个酶切位点的特定引物SEQIDNo:5和SEQIDNo:6，扩增得到人CYP1A2基因片段NM_000761,其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示。（3）经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序。（4）测序正确后，转染MDCK-hOAT1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，进行mRNA验证并通过经典底物对氨基马尿酸及抑制剂丙磺舒进行OAT1的功能验证以及通过经典底物非那西丁进行CYP1A2的功能验证。本专利技术的另一个目的是提供所述共表达OAT1和CYP1A2的细胞模型在OAT1和CYP1A2底物或抑制剂初步筛选中的应用，或者考察两者在介导药物的细胞毒性中的作用。通过以下步骤实现：加入50umol/L待测药物，孵育48h，置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态和数目变化，将细胞用PBS缓冲液洗两次，加入甲醇固定15min。加入0.5μmol/LDAPI染色液室温避光作用15min。将染色后的细胞置于倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态和数量变化，加入0.5mg/mLMTT继续孵育4h，加入200μLDMSO孵育10min，于酶标仪570nm处读取吸光度值。吸光度值越小，细胞成活量越低，表明待测药物毒性越大。本专利技术提供一种共表达细胞模型，具有稳定高表达人OAT1和CYP1A2两种蛋白的优势，可以作为基于OAT1和CYP1A2的药物毒性作用在细胞水平上的毒性筛选模型，以及研究OAT1和CYP1A2在药物处置中的协同作用。本专利技术的积极效果是：（1）而本专利技术构建的MDCK-hOAT1/CYP1A2细胞共转染转运蛋白与代谢酶，可以在体外同时研究两者在药物处置中的作用。本专利技术建立的细胞模型可以作为OAT1和CYP1A2的底物的筛选模型，预测药物在体内的转运和代谢情况。（2）越来越多的报道中药具有肾毒性，因此，中药肾毒性的快速有效筛选已成为中药研究开发和临床应用的障碍。中药肾毒性早期快速，有效地筛选尤为重要。本专利技术提供的细胞模型可以预测中药成分的毒性情况。（3）目前临床上多采用联合用药方式治疗，合用不同药物可能会引起不良反应，本专利技术提供的细胞模型可以用来研究基于hOAT1和CYP1A2的药物-药物相互作用。附图说明图1A质粒pcDNA3.1(+)/OAT1经EcoRI和NheI双酶切鉴定电泳图。条带Marker为MarkerDL15000，条带1，2分别为质粒pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1(+)/OAT1经EcoRI和NheI双酶切电泳图。图1B质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2经BamHI和NheI双酶切鉴定电泳图。条带Marker为MarkerⅢ，条带1，2分别为质粒pcDNA3.1/Hygro(+)，pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2经NheI和BamHI双酶切电泳图。图2OAT1在MDCK-OAT1细胞中的转录水平。图中数据以mean±SD表示，n=3。Mock为转染空载体细胞，D3和F8分别为转染OAT1的单克隆细胞。图3在有或无抑制剂丙磺舒（1mmol/L）作用下，6-CFL（4µmol/L）在MDCK-OAT1细胞中的积聚。图中数据以mean±SD表示，n=4。Mock为转染空载体细胞，D3和F8分别为转染OAT1的单克隆细胞。图4在有或无抑制剂丙磺舒（1mmol/L）作用下，对氨基马尿酸（5µmol/L）在MDCK-OAT1细胞中的积聚。图中数据以mean±SD表示，n=3。Mock为转染空载体细胞，D3和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）以人基因OAT1 cDNA为模板，通过设计含EcoR I和NheI双酶切位点的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，扩增得到人OAT1基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，经过双酶切的PCR产物和载体pcDNA3.1(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到稳定高表达OAT1的MDCK细胞；（2）然后从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamH I和Nhe I两个酶切位点的特定引物SEQ ID No:5和 SEQ ID No:6，扩增得到人CYP1A2基因片段NM_000761,其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；（3）经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；（4）测序正确后，转染MDCK‑hOAT1细胞，经过潮霉素B筛选，得到共表达OAT1和CYP1A2细胞，进行mRNA验证并通过经典底物对氨基马尿酸及抑制剂丙磺舒进行OAT1的功能验证以及通过经典底物非那西丁进行CYP1A2的功能验证。...
【技术特征摘要】
1.一种共表达摄取转运体和药物代谢酶细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）以人基因OAT1cDNA为模板，通过设计含EcoRI和NheI双酶切位点的特定引物SEQIDNo:3和SEQIDNo:4，扩增得到人OAT1基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQIDNo:1所示，经过双酶切的PCR产物和载体pcDNA3.1(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1(+)/OAT1，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；测序正确后，转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418筛选出单克隆细胞，得到MDCK-hOAT1细胞；（2）然后从冰冻人肝组织中提取总RNA，经逆转录获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamHI和NheI两个酶切位点的特定引物SEQIDNo:5和SEQIDNo:6，扩增得到人CYP1A2基因片段,其核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；（3）经过双酶切的PCR产物和带有潮霉素B筛选标记的载体pcDNA3.1/Hygro(+)片段，通过T4连接酶连接，构建质粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，转化大肠杆菌进行质粒扩增，测序；（4）测序正确后，转染MDC...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾苏，赵垒，胡海红，余露山，蒋惠娣，周惠，徐思云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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