酵素型基因芯片的侦测法制造技术

一种酵素型基因芯片的侦测法，分为RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测等五个步骤，共有十七种试剂参与反应，并根据完成后的结果可观察管家基因的表现情形。藉此，透过本发明专利技术提出的侦测法，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。

【技术实现步骤摘要】
酵素型基因芯片侦测试剂组
本专利技术有关于一种酵素型基因芯片侦测试剂组，尤指涉及一种以十七种试剂参与基因芯片反应流程，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现的酵素型基因芯片的侦测法。
技术介绍
对基因过渡表现(Overexpression)的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法(NorthernBlot)、反转录聚合酶链锁反应(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)及实时定量聚合酶链锁反应(Real-TimePCR)。其中NorthernBlot由于操作步骤十分繁琐，所需检体量又过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于RT-PCR及Real-TimePCR由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR序列的创作系作为整体最伟大的实验，但多数PCR技术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有：其一是污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如雾式的DNA或先前的样品残余；其二是RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时，难以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子(Primer)间黏合(Annearling)的干扰，无论RT-PCR或Real-TimePCR都仅广泛应用于单一基因标的的检测，当检测标的为基因群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视，本专利技术的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片(MembraneArray)方法，能使用于癌症诊断，在血液检体(PeripheralBlood)中同时查出一多种mRNA标记引物的表达水平。其分子标志的表达水平由RT-PCR与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系(r＝0.979，P<0.0001)。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片(WeightedChemiluminescentMembraneArray,WCHMA)用于肺癌(LungCancer)患者的血液检体分析标的治疗药物(TargetTherapeuticDrug)的作用标的K-ras的异常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。对此，本专利技术另外研究开发一基因群检测结构，虽可大量并快速进行生物检体检测分析，但其检测过程需先行放大，并无法达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，导致在芯片检测灵敏度及方便性等方面的要求仍嫌不足；故，一般无法符合使用者于实际使用时所需。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性需求的酵素型基因芯片侦测试剂组。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种酵素型基因芯片侦测试剂组，该试剂组包括基因芯片、和依次参与RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测步骤所需试剂；其中，上述RNA萃取是：取200～500μl欲处理的血液检体与20～50μl蛋白酶溶液及200～500μl裂解溶液混合均匀，置于45～67℃反应8～12分钟后，加入20～50μl磁珠溶液与300～500μl结合溶液混合均匀，置于20～30℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700～1200μl清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入一20～100μl溶解溶液混合均匀，接着再置于56～84℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；上述cDNA合成是：将上述RNA溶液置于56～84℃反应8～12分钟后，加入1～5μl引子溶液混合均匀，并置于-0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，接着加入5～10μl反转录溶液与1～5μl反转录酵素溶液混合均匀，置于34～50℃反应96～144分钟后，得到cDNA溶液；上述探针标志是：取10～50μl上述cDNA溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至-0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再加入1～5μl标志溶液混合均匀，置于34～50℃反应192～288分钟后，取得探针溶液；上述杂交反应是：将一基因芯片置入一反应盒，加入2～8ml杂交溶液混合均匀，置于34～50℃反应8～12分钟，另将上述探针溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至-0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再将此探针溶液加入该反应盒中，置于34～50℃反应384～576分钟后，取得探针反应溶液；上述讯号侦测是：将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入2～8ml第一清洗溶液，清洗芯片4～6分钟后移除，重复两次，接着加入2～8ml第二清洗溶液，置于34～50℃清洗4～6分钟后移除，重复两次，加入2～8ml填补溶液，反应24～36分钟后移除，加入2～8ml抗体溶液，反应72～108分钟后移除，加入2～8ml第三清洗溶液，反应4～6分钟后移除，重复两次，最后加入2～8ml呈色溶液，置于34～50℃反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，烘干后即得到侦测结果；上述基因芯片为尼龙膜或热塑性复合材料，该基因芯片选定寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列；该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于10mM～200mM，序列长度介于40～60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补关系。所述热塑性复合材料为聚丙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。所述RNA萃取步骤中的蛋白酶溶液为蛋白酶K溶液。裂解溶液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠及聚乙二醇辛基苯基醚所组成。磁珠溶液为氧化硅基羟基磁珠。结合溶液由聚乙二醇及氯化钠所组成。清洗溶液由乙醇、丙三醇及醋酸铵所组成。溶解溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸所组成。所述cDNA合成步骤中的引子溶液由寡核苷酸引子及随机引子所组成。反转录溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁及二硫代苏糖醇所组成。反转录酵素溶液由反转录酵素及核糖核酸酶抑制剂所组成。所述探针标志步骤中的标志溶液由随机引子、KlenTaq聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、生物素化脱氧三磷酸尿苷、KlenTaq缓冲液及丙三醇所组成。所述杂交反应步骤中的杂交溶液由聚乙二醇、十二基硫酸钠及氯化钠所组成。所述讯号侦测步骤中的第一清洗溶液由十二基硫酸钠及柠檬酸钠所组成。第二清洗溶液为柠檬酸钠。第三清洗溶液由十二基硫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酵素型基因芯片的侦测法，其特征在于，该方法至少包括下列步聚： （A）RNA萃取步骤：取200～500μl欲处理的血液检体与20～50μl蛋白酶溶液及200～500μl裂解溶液混合均匀，置于45～67℃反应8～12分钟后，加入20～50μl磁珠溶液与300～500μl结合溶液混合均匀，置于20～30℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700～1200μl清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入一20～100μl溶解溶液混合均匀，接着再置于56～84℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；（B）cDNA合成步骤：将上述RNA溶液置于56～84℃反应8～12分钟后，加入1～5μl引子溶液混合均匀，并置于‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，接着加入5～10μl反转录溶液与1～5μl反转录酵素溶液混合均匀，置于34～50℃反应96～144分钟后，得到cDNA溶液；（C）探针标志步骤：取10～50μl上述cDNA溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再加入1～5μl标志溶液混合均匀，置于34～50℃反应192～288分钟后，取得探针溶液；（D）杂交反应步骤：将一基因芯片置入一反应盒，加入2～8 ml杂交溶液混合均匀，置于34～50℃反应8～12分钟，另将上述探针溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至‑0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再将此探针溶液加入该反应盒中，置于34～50℃反应384～576分钟后，取得探针反应溶液，其中，该基因芯片选定寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列；以及（E）讯号侦测步骤：将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入2～8 ml第一清洗溶液，清洗芯片4～6分钟后移除，重复两次，接着加入2～8 ml第二清洗溶液，置于34～50℃清洗4～6分钟后移除，重复两次，加入2～8 ml填补溶液，反应24～36分钟后移除，加入2～8 ml抗体溶液，反应72～108分钟后移除，加入2～8 ml第三清洗溶液，反应4～6分钟后移除，重复两次，最后加入2～8 ml呈色溶液，置于34～50℃反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，烘干后即得到侦测结果。...

【技术特征摘要】
2012.11.28 TW 1011444161.一种酵素型基因芯片侦测试剂组，其特征在于，该试剂组包括基因芯片、和依次参与RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测步骤所需试剂；其中，上述RNA萃取是：取200～500μl欲处理的血液检体与20～50μl蛋白酶溶液及200～500μl裂解溶液混合均匀，置于45～67℃反应8～12分钟后，加入20～50μl磁珠溶液与300～500μl结合溶液混合均匀，置于20～30℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700～1200μl清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入20～100μl溶解溶液混合均匀，接着再置于56～84℃反应8～12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；其中，蛋白酶溶液为蛋白酶K溶液；裂解溶液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠及聚乙二醇辛基苯基醚所组成；结合溶液由聚乙二醇及氯化钠所组成；清洗溶液由乙醇、丙三醇及醋酸铵所组成；溶解溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸所组成；上述cDNA合成是：将上述RNA溶液置于56～84℃反应8～12分钟后，加入1～5μl引子溶液混合均匀，并置于-0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，接着加入5～10μl反转录溶液与1～5μl反转录酵素溶液混合均匀，置于34～50℃反应96～144分钟后，得到cDNA溶液；其中，引子溶液由寡核苷酸引子及随机引子所组成；反转录溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁及二硫代苏糖醇所组成；反转录酵素溶液由反转录酵素及核糖核酸酶抑制剂所组成；上述探针标志是：取10～50μl上述cDNA溶液置于76～114℃反应4～6分钟后，降温至-0.5～0.5℃反应1.5～2.5分钟，再加入1～5μl标志溶液混合均匀，置于34～50℃反应192～288分钟后，取得探针溶液；其中，标志溶液由随机引子、KlenTaq聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、生物素化脱氧三磷酸尿苷、KlenTaq缓冲液及丙三醇所组成；上述杂交反应是：将一基因芯片置入一反应盒，加入2～8ml杂交溶液混合均匀，置于34～50℃反应8～12分钟，另将上述探针溶液置于76～114℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴昌翰，林绣茹，刘雪娇，
申请(专利权)人：康隽生物科技股份有限公司，辅英科技大学附设医院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71