微量核酸样本的文库制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及微量核酸样本的文库制备方法及其应用，所述方法包括：用DOP(Degenerate?Oligonucleotide?Primed)引物对样本中的DNA进行第一次扩增，DOP引物序列具有至少5′端非简并核苷酸区和3′端简并核苷酸区；用DOP-Amp引物对第一PCR产物进行第二次扩增，获得第二PCR扩增产物；对第二PCR扩增产物进行接头连接PCR(adaptor-ligation?PCR)，获得第三PCR产物，两端带有测序接头的第三PCR产物即为核酸文库。所述文库可以进行片段大小选择和高通量测序，得到样本中疾病相关的基因信息。本发明专利技术还提供一种试剂盒及其在所述微量核酸样本文库制备的用途。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体地涉及微量核酸样本的文库制备方法及其应用。
技术介绍
新一代测序技术(NGS)改变了以往对DNA/RNA样本的分析模式，几乎成为所有研究领域中必不可少的研究工具。新一代测序技术是通过对上百万条DNA短片段的同时的平行测序，使得在短时间内就能够完成每个碱基的测序，且成本大幅度降低。NGS技术在很多方面得到应用，如基因组学、转录组学、表观基因组学、临床诊断等。目前市场上新一代测序技术NGS平台有好几种，包括Illumina公司的GenomeAnalyzer、Hiseq、Miseq 系列测序平台，Roche 公司的 454 测序平台，Life Technologies 公司的SOLID测序平台、Ion Torrent测序平台等等。但是无论何种NGS平台，在测序前都需对DNA/RNA样本进行处理，制备成DNA片段文库。通常情况下，文库的制备需要微克级的起始DNA/RNA量，虽然经优化可以将建库起始量降低，但对于单细胞或极微量的核酸样本，仍无法直接进行文库制备，因此严重阻碍了对单细胞和微量核酸测序的应用。因此本领域迫切需要开发针对单细胞和微量核酸样本的文库构建方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对微量核酸样本进行文库制备的 方法和用途。本专利技术的另一目的是提供一种使用上述方法的试剂盒及其用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种制备核酸文库的方法，包括步骤a.提供一待测样本，所述样本含有的核酸总量为2皮克 I微克；b.对待测样本进行D0P-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR)扩增，获得第一 PCR扩增产物；C.用DOP-Amp弓I物对第一 PCR扩增产物进行第二次PCR扩增，获得第二 PCR扩增产物；d.对获得的第二 PCR扩增产物进行接头连接PCR (adaptor-1 igation PCR)，获得第三PCR扩增产物，即为核酸文库。在另一优选例中，所述的第三PCR扩增产物的5'端具有接头，且3'端具有接头。在另一优选例中，还包括步骤(e):对第三PCR扩增产物依据片段大小进行选择。在另一优选例中，步骤(a)中所述的样本选自下组1-200个单细胞构成的样本，或含有1-200个单细胞的核酸样本，或核酸总含量为2皮克 I微克的核酸样本。在另一优选例中，所述样本选自下组微量基因组DNA、免疫共沉淀产物DNA、游离DNA、cDNA、或其组合。 在另一优选例中，所述DNA来自环境，更佳地，来自土壤和/或水体。在另一优选例中，所述DNA来自体液或排泄物，更佳地，来自血浆和/或尿液。在另一优选例中，所述的DNA经化学或物理方法处理，更佳地，经亚硫酸氢盐处理。在另一优选例中，步骤(b)使用带有简并寡核苷酸区的DOP引物对样本DNA进行随机扩增。在另一优选例中，所述的DOP引物具有位于5'端的非简并寡核苷酸区和位于中部的简并寡核苷酸区和3'端的锚定区；或者位于5'端的非简并寡核苷酸区和位于中部和3'端的简并寡核苷酸区。在另一优选例中，所述DOP引物的3'端锚定区的序列长度为2-12个核苷酸，较佳地4-8个核苷酸。在另一优选例中，所述DOP引物的3'端锚定区任选自下组TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT。在另一优选例中，所述DOP引物的5'端非简并寡核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示,或与SEQ ID NO : 2所示序列的同源性彡50%。在另一优选例中，所述的DOP引物的Y端非简并寡核苷酸长度为5_30bp，较佳地5-20bp，更佳地 6-13bp 。在另一优选例中，所述的简并寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每个碱基位置上的N包括A、T、G和C，m为3-20的正整数。在另一优选例中，，步骤(C)所述的DOP-Amp引物与步骤(b)所述的5’端非简并寡核苷酸互补或基本上互补。在另一优选例中，DOP-Amp引物序列结合于DOP引物5’端非简并寡核苷酸区。在另一优选例中，DOP-Amp引物序列如SEQ ID NO 2所示。在另一优选例中，步骤(d)用接头引物进行接头连接PCR扩增。在另一优选例中，所述的接头引物为P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可结合于DOP-Amp引物序列的非简并寡核苷酸区，所述的非简并寡核苷酸区的序列与SEQ ID NO 2所示序列相同或完全互补,或者与SEQ ID NO :2所示序列有> 80%的同源性。在另一优选例中，所述的接头引物P7还具有标签(barcode或index)序列。在另一优选例中，步骤(e)中所述的依据片段大小进行选择为在第三PCR扩增产物中选择IOO-1OOObp长度的片段。在另一优选例中，所述的依据片段大小进行选择为在第三PCR扩增产物中选择200-500bp长度的片段。在本专利技术的第二方面，提供了一种检测微量核酸样本中核苷酸序列的方法，包括步骤(i)对于所提供的单细胞及微量核酸样本，用本专利技术第一方面任一所述的方法制备所述样本的核酸文库；(ii)对所述核酸文库中的片段进行测序和数据分析。在另一优选例中，所述的测序为第二代高通量测序法，更佳地，所述第二代高通量测序法选自下组Roche454 FLX、Illumina Solexa或ABI SOLID测序平台。在另一优选例中，所述的测序包括步骤将需要测序的核酸文库与测序芯片(flow cell)上固定的测序探针进行杂交，并进行固相桥式PCR扩增，形成测序簇；对所述测序簇用“边合成-边测序”法进行测序，获得样本中核苷酸序列信息。在本专利技术的第三方面，提供了一种可用于本专利技术第一方面和第二方面任一方法的试剂盒，所述试剂盒包括(I)第一容器以及位于容器内的用于进行第一 PCR扩增的DOP引物；(2)第二容器以及位于容器内的用于进行第二 PCR扩增的DOP-Amp引物；(3)第三容器以及位于容器内的用于进行第三PCR扩增的接头连接引物；(4)说明书。在另一优选例中，所述试剂盒还包括用于进行PCR扩增所需的试剂、用于核酸纯化的试剂、用于进行高通量测序的测序芯片(flow cell)、或其组合。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示一个典型的构建文库及测序的流程示意图。图2显示用DOP-PCR方法制备单细胞基因组DNA文库接头连接PCR产物的电泳图。图3显示四个样本(YH1，YH2，YH3，T21)的接头连接PCR产物经片段选择和纯化后，进行片段检测的结果。图3A为样本YHl检测结果，需要的主带位于377bp ;图3B为样本YH2检测结果，需 要的主带位于326bp ;图3C为样本YH3检测结果，需要的主带位于339bp ;图3D为样本T21检测结果，需要的主带位于360bp。图4显示用DOP-PCR方法制备微量核酸样本(IP产物DNA，Plasma DNA, cDNA，gDNA)的接头连接PCR产物电泳胶图。图5显示用DOP-PCR方法制备微量DNA/cDNA样本的文库，经片段选择和纯化后片段检测的结果。图5A为微量基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备核酸文库的方法，其特征在于，包括步骤：a.提供一待测样本，所述样本含有的核酸总量为2皮克～1微克；b.对待测样本进行DOP?PCR扩增，获得第一PCR扩增产物；c.用DOP?Amp引物对第一PCR扩增产物进行第二次PCR扩增，获得第二PCR扩增产物；d.对获得的第二PCR扩增产物进行接头连接PCR，获得第三PCR扩增产物，即为核酸文库；较佳地，所述的第三PCR扩增产物的5′端具有接头，且3′端具有接头。

【技术特征摘要】
1.一种制备核酸文库的方法，其特征在于，包括步骤 a.提供一待测样本，所述样本含有的核酸总量为2皮克 I微克； b.对待测样本进行DOP-PCR扩增，获得第一PCR扩增产物；c.用DOP-Amp弓I物对第一PCR扩增产物进行第二次PCR扩增，获得第二 PCR扩增产物；d.对获得的第二PCR扩增产物进行接头连接PCR，获得第三PCR扩增产物，即为核酸文库； 较佳地，所述的第三PCR扩增产物的5'端具有接头，且3'端具有接头。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(e) 对第三PCR扩增产物依据片段大小进行选择。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的样本选自下组 1-200个单细胞构成的样本，或 含有1-200个单细胞的核酸样本，或 核酸总含量为2皮克 I微克的核酸样本； 较佳地，所述样本选自下组微量基因组DNA、免疫共沉淀产物DNA、游离DNA、cDNA、或其组合； 或所述DNA具有选自下组的一个或多个特征 所述DNA来自环境，更佳地，来自土壤和/或水体； 所述DNA来自体液或排泄物； 所述DNA来自来自血浆和/或尿液； 所述DNA经化学或物理方法处理； 所述DNA经亚硫酸氢盐处理。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)使用带有简并寡核苷酸区的DOP引物对样本DNA进行随机扩增； 所述的DOP引物具有选自下组的一个或多个特征 所述的DOP引物具有位于5'端的非简并寡核苷酸区和位于中部的简并寡核苷酸区和3'端的锚定区； 所述的DOP引物具有位于5'端的非简并寡核苷酸区和位于中部和3'端的简并寡核苷酸区； 所述DOP引物的3'端锚定区的序列长度为2-12个核苷酸； 所述DOP引物的3'端锚定区的序列长度为4-8个核苷酸； 所述DOP引物的3'端锚定区任选自下组TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT ； 所述DOP引物的5'端非简并寡核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 所述DOP引物的5'端非简并寡核苷酸序列与SEQ ID NO :2所示序列的同源性> 50%;所述的DOP引物的5'端非简并寡核苷酸长度为5-30bp，较佳地5-20bp，更佳地6_13bp ； 所述的简并寡核苷酸序列如(N) m所示，其中每个碱基位置上的N包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷旭阳，张春雷，蒋慧，张秀清，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：