本发明专利技术公开了一种用OMC685-1细胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法，用OMC685-1细胞做呼吸道合胞病毒分离工具，用倒置显微镜观察细胞病变效应和间接免疫荧光法检测病毒，具体包括培养OMC685-1细胞、感染OMC685-1细胞系和倒置显微镜观察CPE以及免疫荧光检测呼吸道合胞病毒，本发明专利技术的分离培养方法可以直观的判断收集标本是否有RSV，方法简单，重复性好，灵敏度高，费时短，成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种呼吸道合胞病毒的分离培养方法，具体涉及ー种用0MC685-1细胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法。
技术介绍
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)属于副粘病毒科肺炎病毒属，电镜下形态多祥，可以是纤毛状或近似球状。RSV对环境中各种因素的耐受カ很差，较高的温度、低pH、有机溶剂、去污剂等都能使它很快灭活。因此临床分离病毒时要求尽快接种到敏感細胞上。RSV能在ー些传代细胞中生长，例如HEp-2，HeLa, HFF, A549以及恒河猴肾細胞。在理想条件下，最早可在接种后两天看到RSV特有的融合細胞，但通常需要4-5天才能看到細胞病变效应(CPE)。虽然病毒培养是从临床标本中检测RSV的最好方法，但传统的細胞管方法因耗时较长(1 2周)。 小瓶培养法可接种相同量的标本，可将分离时间从7 10天减少到1 2天，因此得到广泛应用。0MC685細胞系是本单位万启惠、李宗权、徐大刚和吴中明等建立的一株人卵巣粘液性囊腺癌細胞系，文献来源《人卵巣粘液性囊腺癌細胞系的建立及生物学特性的研究》，中华妇产科杂志，2001年7月第36卷第7期，421-423。本专利技术中的0MC685-1细胞是0MC685 細胞系采用有限稀释法克隆纯化得到的。本专利技术采用0MC685-1細胞做呼吸道合胞病毒分离工具，用倒置显微镜观察細胞病变效应和间接免疫荧光法检测病毒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题解决目前RSV病原体分离存在的灵敏度低、费时较长等问题，本专利技术用人卵巣粘液性囊腺癌細胞(0MC685-1)作为工具，分离RSV病毒，与传统的病毒分离方法相比提高了检测的灵敏度，并缩短了培养时间。本专利技术采用的技术方案本专利技术用0MC685-1細胞做呼吸道合胞病毒分离工具，倒置显微镜观察细胞病变效应， 再用间接免疫荧光法确认病毒。本专利技术用0MC685-1細胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法，包括以下步骤(1)培养0MC685-1细胞0MC685-1细胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，置于相对湿度为95 % 98 %，37°C，5 % CO2及37°C条件下培养；每2 3d换液1 次，4 5d传代1次；将生长良好的細胞用0. 25 %胰酶消化后制成细胞悬液，以IX IO5个 /孔的密度接种于96孔培养板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后感染病毒；(2)感染0MC685-1細胞，用PBS反复冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余PBS液， 每孔接种40ul含呼吸道合胞病毒的标本，对照孔接种PBS液40ul，感染1- 后用无血清 RPMI-1640培养液冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余液体，每孔加入0. Iml維持液，含1小牛血清的RPMI-1640培养液，每4-1 倒置显微镜下观察一次是否出现细胞病变效应； (3)收集感染細胞做间接免疫荧光法检测确认病毒。本专利技术达到的有益效果本课题组研究0MC685-1发现，对RSV敏感性较高，低滴度的RSV即引起細胞出现 CPE，用RSV抗体检测RSV，可在0MC685-1細胞胞浆内发现明显的绿色荧光颗粒；对感染 0MC685-1細胞或上清提取RNA，逆转录后用RSV特异弓|物进行PCR扩增，可以扩增出单一目的条带，由此说明0MC685细胞对RSV敏感，可以用来分离培养RSV。敏感細胞的使用，对RSV相关研究，是ー种重要的工具。现国内外常用的敏感细胞有HEp-2，Hela等。0MC685細胞系是本课题组万启惠、李宗权、徐大刚和吴中明等建立的一株人卵巣粘液性囊腺癌細胞系，对脊髓灰质炎病毒I型、腺病毒7型及麻疹病毒敏感。为了摸索更多分离RSV工具，本专利技术用0MC685细胞经有限稀释法克隆化后得到0MC685-1，经 RSV感染并以Hela細胞作实验对照，对其敏感性进行判断。结果发现，采用0MC685-1細胞在感染后6-10h开始出现CPE，16h后各孔细胞均出现了明显的CPE，24h后能明显的观察到融合細胞，4^1-7 后病变细胞开始脱落。而Hela在24h后才开始出现CPE ；0MC685-1细胞的 TCID50=IO-9.0, JEC 细胞 TCID5ci=IO-8125, Hela 细胞 TCID5(1=l(r5·5，表明 0MC685-1 细胞对 RSV的敏感性大大高于Hela細胞。用新的細胞工具0MC685-1分离RSV，方法灵敏度高，能检测低滴度的RSV，观察便捷，提高了分离培养的灵敏度，更缩短了分离培养的时间。具体实施例方式本专利技术ー种用0MC685-1細胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法，用0MC685-1細胞做呼吸道合胞病毒分离工具，用倒置显微镜观察細胞病变效应和间接免疫荧光法检测病本专利技术中的0MC685-1细胞是0MC685細胞系采用有限稀释法克隆纯化得到的，步骤如下将0MC685克隆化纯化，对人卵巣粘液性腺癌細胞系进行克隆化处理用有限稀释法将 0MC685細胞制成细胞悬液，用含10%小牛血清的完全培养基稀释细胞至4-5个/毫升，按每孔0. 1毫升细胞悬液接种于96孔板；置37°C 5%C02培养箱，每天观察，在仅有1个细胞的培养孔上做标记；待細胞长满孔底后用0. 25%的胰蛋白酶消化转入培养瓶传代培养，細胞生长旺盛后进行液氮冻存，即为0MC685-1細胞。 实施例1:本专利技术ー种用0MC685-1細胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法，包括以下步骤 (D0MC685-1细胞培养0MC685-1細胞复苏后接种于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，置于相对湿度为 95 % 98 %、5 % CO2及37°C条件下培养。每2 3d换液1次，4 5d传代1次。将生长良好的0MC685-1細胞用0. 25 %胰酶消化后制成细胞悬液，以1 X IO5个/孔的密度接种于96孔培养板，0. 1 ml/孔，置于37°C、5 % CO2培养箱中培养，次日待细胞贴壁铺满孔底； (2)感染細胞和倒置显微镜观察CPE用PBS反复冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余PBS液，每孔接种咽拭子液(上呼吸道感染小孩用药前取咽拭子放入含双抗的无菌试管内处理ai)40ul，对照孔接种PBS液40ul， 感染1-ai后用无血清RPMI-1640培养液冲洗96孔培养板三次，吸干孔内剩余液体，每孔加入维持液(含2、小牛血清的RPMI-1640培养液)0. 1ml，每4_1池观察一次是否出现CPE ；(3)间接免疫荧光法观察48-7池，弃去孔内培养液，PBS反复冲洗三次，然后用冷丙酮固定10分钟，2% Trition-IOO作用5分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，每孔加入1:2 RSV抗体5ul，湿盒37°C 孵育45分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，每孔加入1:30 ニ抗IOul (羊抗鼠IgG FITC)， 湿盒37°C孵育45分钟，PBS液冲洗三次(3min/次)，倒置荧光显微镜观察胞内及包膜緑色荧光，感染组出现明显荧光颗粒，表明用0MC685-1細胞分离培养RSV成功。权利要求1.ー种用0MC685-1細胞分离培养呼吸道合胞病毒的方法，其特征在于用0MC685-1 細胞做呼吸道合胞病毒分离工具，倒置显微镜观本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：敖弟书，吴中明，彭志元，唐君，肖福峰，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：
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