茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法及其糖苷酶活性技术

本发明专利技术公开了茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法及其糖苷酶活性，其分离纯化的方法是将茶多酚提取物经非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂吸附，用水和乙醇洗脱，醇洗脱物再经层析用聚酰胺柱，分别用水和乙醇洗脱。聚酰胺柱的醇洗脱物经水重结晶得ＥＧＣＧ纯品，纯度＞９５％，得率＞５０％；聚酰胺柱的水洗脱物经层析用反相Ｃ１８填料柱层析得ＥＣ和ＥＧＣ，用５０％～８０％乙醇重结晶得纯品ＥＣ、ＥＧＣ，其纯度均在９６％以上。经体外试验ＥＧＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣ对α－葡萄糖苷酶和α－淀粉酶均有抑制活性，可用于制备减少碳水化合物吸收的减肥产品或降低餐后血糖的药物或保健品。

Isolation and purification methods of main catechins in tea polyphenols and their glycosidase activities

The invention discloses a purification method and glycosidase activity separation mainly catechins in tea polyphenols, the method of separation and purification is the tea polyphenol extract by non-polar polystyrene macroporous resin, water and ethanol, alcohol elution by polyamide column chromatography using water and ethanol, respectively. Elution. The polyamide column elution was recrystallized by water to pure EGCG, the purity of more than 95%, the yield of more than 50%; by chromatography by reversed-phase column chromatography and EC C18 packing EGC polyamide column washed off, with 50% to 80% ethanol recrystallization to obtain pure product of EC, EGC, and the purity was more than 96%. In vitro, EGCG EGC, EC can inhibit the activity of alpha glucosidase and alpha amylase were used for the preparation of reduced carbohydrate absorption of slimming products or reduce postprandial blood sugar drugs or health products.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及茶多酚中儿茶素成分的分离纯化方法及所得到的单体的用途。尤其涉及茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表没 食子儿茶素(EGC)三种重要儿茶素成分的分离纯化方法及对三种重要儿茶素 成分a-葡萄糖苷酶和ci-淀粉酶的抑制活性，可用于制备减少碳水化合物吸 收的减肥产品或降低餐后血糖的药物或保健品。
技术介绍
表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC) 是茶叶中含量最高的儿茶素类成分，也是重要的活性成分，具有抗肿瘤、降血 脂、抗氧化、抗衰老、抗艾滋病毒、抗癌转移、抗纤维化、抑菌、抗霉菌、抑 制血管生成等多种活性。近年来各国积极推进应用开发表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿 茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)，用于天然抗氧化剂、自由基清除剂，广 泛用于食品加工、医药保健和日用化工等，故研究其分离方法和简便高效的生 产工艺具有重要现实意义。目前公开的方法主要是用S印hadex LH-20方法， 如CN1199965C、 CN1193994C、 CN1212319C、 CN1283636C;还有用HPLC方法制 备，如CN1164583C;大孔树脂法如CN1733753A;极性树脂XAD-7方法如 EP1767097A2。上述S印hadex LH-20方法、HPLC方法成本高，周期长。如采用单一大孔 树脂方法或聚酰胺方法经初步研究难以制得高纯度单体，因此要大量制备纯度 高的EGCG需要寻找分离操作简单，分离效率高，成本低的分离纯化方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题第一方面是通过对目前报道的表没食子儿茶 素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)分离工艺的改进，提供了一种分离纯化方法简单，分离效率高，成本低，产品得率高的茶 多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法。本专利技术所要解决的技术问题第二方面是提供上述分离纯化后得到的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)单 体的糖苷酶活性。作为本专利技术第一方面的茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，包括以下步骤(1) 将茶多酚提取物加入倍量水使之溶解，上非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱后，依次用水和重量百分比浓度为10% 40%乙醇溶液进行洗 脱，根据硅胶薄层层析检测结果，收集表没食子儿茶素没食子酸酯流份；(2) 将表没食子儿茶素没食子酸酯流份减压回收乙醇至干得样品固体B， 样品固体B用水溶解上层析用聚酰胺柱，然后依次用水和重量百分比浓度为 10% 30%乙醇洗脱，收集聚酰胺柱水洗脱液和乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压蒸 干，再加去离子水溶解重结晶即得表没食子儿茶素没食子酸酯；(3) 聚酰胺柱水洗脱液减压蒸干得样品固体C，样品固体C用重量百分 比浓度为10% 20%乙醇溶解后上层析用反相C18填料柱，用重量百分比浓度为 10% 20%乙醇洗脱，根据硅胶薄层层析检测结果，先后收集表没食子儿茶素流 份和表儿茶素流份，将表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份在减压回收乙醇至 干，用醇液重结晶即得表没食子儿茶素、表儿茶素。所述非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂包括但不限于下述树脂-D101或HPD100或AB-8。在上述步骤(1)中，茶多酚提取物的固体重量与所述非极性或弱极性聚 苯乙烯型大孔吸附树脂重量比为1: 10 50。在上述步骤(2)中，样品固体B重量与层析用聚酰胺重量比1: 10 30。 在上述步骤(2)中，乙醇洗脱液在45t:以下减压蒸干。 在上述步骤(2)中，表没食子儿茶素没食子酸酯加2-5倍重量的去离子 水重结晶，重结晶时加热溶解温度为45t:-65°C，溶解后在4。C-1(TC条件下放 置，待结晶析出，过滤后用少量冷水洗涤，然后于45'C以下减压干燥。在上述步骤(3)中，乙醇洗脱时，最佳的乙醇重量百分比浓度为10%。 在上述步骤(3)中，样品固体C的重量与层析用反相C18填料重量比为51: 15 50。在上述步骤(3)中，用醇液重结晶时，采用重量百分比浓度为50%-80% 乙醇重结晶，重结晶时加热溶解温度为45。C-65°C。作为本专利技术第二方面的表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素 (EC)、表没食子儿茶素(EGC)单体的糖苷酶活性，经体外试验对a-葡萄糖 苷酶和a-淀粉酶均有抑制活性，可用于制备减少碳水化合物吸收的减肥产品 或降低餐后血糖的药物或保健品。本专利技术的分离操作简单，分离效率高，成本低。具体实施例方式为了更好地理解本专利技术，以下将举实例说明，但这并不意味是对本专利技术的 限制。实施例一称取表没食子儿茶素没食子酸酯含量为50%的茶多酚提取物300克，加入 1200mL去离子水使之溶解。取HPD100大孔吸附树脂4kg用95%乙醇装入柱中， 用8L95。/。乙醇洗去树脂中的致孔剂和聚合单体残余，直至洗脱液经浓縮后用气 相检测合格为止。然后用去离子水替换柱中乙醇，将上述茶多酚水液以0.4倍 柱体积/小时流速上样，待样品进入柱体后，先用2倍柱体积的去离子水以0. 4 倍柱体积/小时流速洗脱，再用4倍柱体积20%乙醇洗脱，根据硅胶薄层层析检 测结果，收集表没食子儿茶素没食子酸酯流份，将表没食子儿茶素没食子酸酯 流份在45。C以下减压浓縮至小体积(1500mL)得样品B，样品B以0. 4倍柱体 积/小时流速上2kg层析用聚酰胺(80 100目)柱，待样品B进入柱体后，用 3倍柱体积去离子水洗脱，然后用4倍柱体积20%乙醇洗脱，收集聚酰胺柱水 洗脱液和20%乙醇洗脱液；20%乙醇洗脱液在45。C以下减压回收乙醇至干，加 200mL去离子水在5(TC加热溶解重结晶，4 1(TC条件下放置，待结晶析出， 过滤，用少量冷水洗涤，重结晶2次，结晶于45'C减压干燥，得表没食子儿茶 素没食子酸酯81克，经HPLC测定含量为95. 8%，得率为52%。取聚酰胺柱水洗脱液5g，用少量的10%乙醇溶解，上75g层析用反相C18 填料(Sigma公司，粒度为40 63pm)柱(柱直径为3cm)，用10%乙醇洗脱， 根据硅胶薄层层析检测结果，分别收集表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份，45匸以下减压浓縮至干，分别用50%乙醇重结晶，结晶在40 45C条件下减压 干燥，得表没食子儿茶素1. 5g，经HPLC测定含量为96. 5%，表儿茶素1.0g， 经HPLC测定含量为96. 8%。实施例二称取表没食子儿茶素没食子酸酯含量为50%的茶多酚提取物100克，加入 400mL去离子水使之溶解。取D101大孔吸附树脂1. Okg用95%乙醇装入柱中， 用95%乙醇洗去树脂中的致孔剂和聚合单体残余，直至洗脱液经浓縮后用气相 检测合格为止，然后用去离子水替换柱中乙醇，将上述茶多酚水液以0.3倍柱 体积/小时流速上样，待样品进入柱体后，先用3倍柱体积的去离子水以0.3 倍柱体积/小时流速洗脱，再用4倍柱体积40%乙醇以0. 3倍柱体积/小时流速 洗脱，根据硅胶薄层层析检测结果，收集表没食子儿茶素没食子酸酯流份，在 45°C以下减压浓縮至小体积(600mL)得样品B，样品B以0. 3倍柱体积/小时 流速上lkg层析用聚酰胺(80 100目)柱，待样品本文档来自技高网...

【技术保护点】
茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：　（１）将茶多酚提取物加入倍量水使之溶解，上非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱后，依次用水和重量百分比浓度为１０％～４０％乙醇溶液进行洗脱，根据硅胶薄层层析检测结果，收 集表没食子儿茶素没食子酸酯流份；　（２）将表没食子儿茶素没食子酸酯流份减压回收乙醇至干得样品固体Ｂ，样品固体Ｂ用水溶解上层析用聚酰胺柱，然后依次用水和重量百分比浓度为１０％～３０％乙醇洗脱，收集聚酰胺柱水洗脱液和乙醇洗脱液；乙醇洗脱液 减压蒸干，再加去离子水溶解重结晶即得表没食子儿茶素没食子酸酯；　（３）聚酰胺柱水洗脱液减压蒸干得样品固体Ｃ，样品固体Ｃ用重量百分比浓度为１０％～２０％乙醇溶解后上层析用反相Ｃ１８填料柱，用重量百分比浓度为１０％～２０％乙醇洗脱，根据硅 胶薄层层析检测结果，先后收集表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份，将表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份在减压回收乙醇至干，用醇液重结晶即得表没食子儿茶素、表儿茶素。

【技术特征摘要】
1.茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将茶多酚提取物加入倍量水使之溶解，上非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂柱后，依次用水和重量百分比浓度为10％～40％乙醇溶液进行洗脱，根据硅胶薄层层析检测结果，收集表没食子儿茶素没食子酸酯流份；(2)将表没食子儿茶素没食子酸酯流份减压回收乙醇至干得样品固体B，样品固体B用水溶解上层析用聚酰胺柱，然后依次用水和重量百分比浓度为10％～30％乙醇洗脱，收集聚酰胺柱水洗脱液和乙醇洗脱液；乙醇洗脱液减压蒸干，再加去离子水溶解重结晶即得表没食子儿茶素没食子酸酯；(3)聚酰胺柱水洗脱液减压蒸干得样品固体C，样品固体C用重量百分比浓度为10％～20％乙醇溶解后上层析用反相C18填料柱，用重量百分比浓度为10％～20％乙醇洗脱，根据硅胶薄层层析检测结果，先后收集表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份，将表没食子儿茶素流份和表儿茶素流份在减压回收乙醇至干，用醇液重结晶即得表没食子儿茶素、表儿茶素。2. 根据权利要求1所述的茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，其特 征在于，所述非极性或弱极性聚苯乙烯型大孔吸附树脂包括为D101或HPD100 或AB-8中的一种。3. 根据权利要求1所述的茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，其特 征在于，在上述步骤(1)中，茶多酚提取物的固体重量与所述非极性或弱极 性聚苯乙烯型大孔吸附树脂重量比为1: 10 50。4. 根据权利要求1所述的茶多酚中主要儿茶素成分分离纯化方法，其特 征在于，在...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋纯清，叶晓平，茅仁刚，
申请(专利权)人：上海新康制药厂，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]