一种中华鳖ＤＮＡ指纹鉴定方法技术

本发明专利技术涉及到一种中华鳖ＤＮＡ指纹鉴定方法，其采用的技术方案为：先从中华鳖肌肉中快速提取高纯度的基因组ＤＮＡ，然后进行随机扩增引物和扩增反应程序的筛选与建立。具体包括以下步骤：（１）肌肉的预处理，包括烘干温度与水分含量等；（２）基因组ＤＮＡ提取条件的优化，如水浴时间、温度及离心速度与时间等；（３）ＰＣＲ扩增反应体系与程序的建立，包括模板、引物和酶的加入量等及退火温度、时间及循环次数的设计等；（４）在最佳扩增条件下进行不同随机引物的筛选以建立不同地域中华鳖的分子标记。与常规形态鉴别技术相比，本技术具有快速、准确的特点，不受饲养外界环境条件的影响，可迅速鉴别出具有不同地域特征的中华鳖亲本，为成功开展杂交育种奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到生物
，具体指一种中华鳖DNA指纹鉴定方法
技术介绍
我国中华鳖养殖发展十分迅猛，其养殖规模和技术集成程度已成为淡水养殖的龙 头行业，据不完全统计，年产量超过15万吨，产值60多亿元，仅浙江省年需求5-10亿只鳖 苗，而源于本地的太湖品系的江南花鳖，苗种的年供应能力只有1-2亿只，大量的鳖苗或卵 由台湾、泰国等地输入，致使优质中华鳖苗种资源遭受了严重混杂和衰退威胁，出现了种质 退化的征兆，给养鳖业带来了极大危害。 一方面，由于忽视种质保护、提纯选育等源头工作， 国内中华鳖种群与品系混杂，近亲交配严重，后代遗传多样性不断减少，有害的基因不断被 纯化，中华鳖种质严重退化，天然的优良商品性状发生严重退化，抗病性和免疫力降低，生 长缓慢，商品鳖品质下降，性成熟提前，性成熟个体体形趋小型化；商品鳖品质下降，肉质鲜 味减退，老百姓接受程度下降，出现丰产不丰收的现象；另一方面，由台湾、泰国等地输入 的苗种质量良莠不齐，给本地区中华鳖种质资源带来混杂退化的威胁。优质中华鳖苗种的 紧缺，已经成为制约养鳖产业发展的瓶颈之一。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能快速进行中华鳖 DNA指纹鉴定的方法，以达到鉴别、选育和保护中华鳖品种的目的。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为该中华鳖DNA指纹鉴定方法，其 特征在于包括下述步骤 ①肌肉样品预处理取待测中华鳖样品肌肉，对该肌肉在40-45t:温度烘干，烘干 后的肌肉水分含量为3-5% ; ②提取基因组DNA :采用试剂盒微量提取法提取上述烘干后的样品肌肉中的基因 组DNA，提取条件为水浴温度为50-55。C、水浴时间为40-45min，离心转速为10000-12000r/ min、离心时间为5-10min，得到高纯度DNA基因组，该基因组的A26。/A28。为1. 7 1. 9 ; ③建立PCR扩增反应体系反应总体积为20-25 ii L，其中10XBuffer 2-2. 5 ii L、 25mMMgCl2 1. 6-2. 0ii L、2mM dNTPO. 4-0. 5 ii L、Taq酶0. 25-0. 4 ii L、5 ii M随机引物2 ii L (由 上海生物工程有限公司合成)、DNA模板1 ii L ;PCR反应的退火温度为36-38°C ，循环次数为 40-45次; ④确立中华鳖特征性分子标记采用RAPD随机引物S105、 S327和S474作为区分 不同地域中华鳖的特征性分子标记。 与现有技术相比，本专利技术具有快速、准确的特点，不受饲养外界环境条件的影响， 可迅速鉴别出具有不同地域特征的中华鳖亲本，为成功开展杂交育种奠定基础。附图说明 图1为DNA电泳图，从左到右依次为江南花鳖②、江南花鳖①、黄河鳖②、黄河鳖 ①、日本鳖②、日本鳖① 图2为本专利技术实施例中RAPD随机引物S105和S327的PCR扩增图； 图3为本专利技术实施例中RAPD随机弓I物S474的PCR扩增图。具体实施例方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。 样品预处理本实验所用的材料为日本鳖、黄河鳖和江南花鳖。采自浙江绍兴国家 级中华鳖原种场。各样品活体解剖，取头部、颈部和四肢肌肉组织，混合，在40-45t:的恒温 箱中烘干。之后用粉碎机磨成肌肉粉，锡纸分包密封保存于室温下。 中华鳖基因组DNA提取条件研究由于经典提取法既需要较多的样品，样品一般 需要50-100g，花费时间较长。鉴于中华鳖原种样品的价格比较贵，又考虑到提取时间等 问题，本专利采用上海生物工程有限公司生产的试剂盒进行基因组DNA的提取，样品仅需 0.05-0. lg。分析不同条件下提取到的中华鳖基因组DNA的浓度和纯度。具体操作步骤如下 (1)称取50mg三种鳖样混合样品，放入1. 5ml离心管中，用200 y 1上海生物工程 有限公司出品的TE缓冲悬浮液悬浮； (2)加入400ii1由试剂盒提供的细胞裂解液(Cell Lysis Solution)混匀，然后 再加入6iU上海生物工程有限公司生产的蛋白酶K混匀，置于50-6(TC水浴30-50min，期 间上下混匀5-6次； (3)加入600 Pi氯仿，混匀，不能振荡太剧烈； (4)4。C下10000r/min离心3min，此时分成3层，取400 y 1上清液，置于1. 5ml离 心管中； (5)加入400ii1由试剂盒提供的DNA沉淀液(Precipication Solution)混匀，室 温放置2min，8000-12000r/min，离心3-8min ; (6)吸去上清液，立即加入100 ill 1. 2mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶 解，加入3 ii 1 RNase A，置于37°C 5-10min ; (7)加入300 ii l-20。C下预冷的乙醇，-20。C放置30min， 10000r/min离心5-8min， 吸去或倒掉乙醇，再用70%乙醇洗两次，倒置室温干燥10min，DNA用100 yl无菌水充分溶解，置于4t:冰箱保存备用。 取50iU待测DNA溶液于1. 5ml离心管中，用无菌水稀释10倍，混匀；在紫外分 光光度计上分别测波长为260nm和280nm处的吸光度A值；其中DNA浓度(yg/ml)= A26。X50X稀释倍数，DNA纯度=A26。/A28。。根据A26。/A28。的值比较所提取的总DNA的纯度， 当46。/48。值在1. 6_1. 9时，说明提取的DNA较纯；当46。/48。值大于2. O，说明样品中有RNA 存在；当A，/A，值小于1.6，说明样品中有少许蛋白质存在。 表1所示的为不同水浴温度和时间对中华鳖基因组DNA提取效果的影响，表2所 示为不同离心速度和时间对中华鳖基因组DNA提取效果的影响。从表1和表2中的A26。/ A，可看出，55t:、40min和10000rpm、5min提取条件下的最接近1.8。由此认为中华鳖 基因组DNA的试剂盒法提取条件以水浴温度50-55t:、水浴时间为40-45min、离心条件为10000-12000r/min、5-10min为宜。 表1不同水浴温度和时间对中华鳖基因组DNA提取效果的影响 <table>table see original document page 5</column></row><table> 表2不同离心速度和时间对中华鳖基因组DNA提取效果的影响<table>table see original document page 5</column></row><table> PCR反应体系和程序的建立PCR反应体系是扩增是否成功的关键性因素之一，包括底物dNTP、 Taq酶、随机引物、MgCl2、 DNA模板及反应缓冲液的浓度和比例等。经过多次摸索，PCR反应条件参照标准方法即94。C预变性3min，94。C变性45s、36。C退火45s、72。C延伸90s，45次循环，72t:再延伸10min进行。根据PCR扩增产物电泳图特异性条带的显示情况，取5yL PCR扩增产物与liiL溴酚蓝上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中华鳖ＤＮＡ指纹鉴定方法，其特征在于包括下述步骤：　　①肌肉样品预处理：取待测中华鳖样品肌肉，对该肌肉在４０－４５℃温度烘干，烘干后的肌肉水分含量为３－５％；　　②提取基因组ＤＮＡ：采用试剂盒微量提取法提取上述烘干后的样品肌肉中的基因组ＤＮＡ，提取条件为水浴温度为５０－５５℃、水浴时间为４０－４５ｍｉｎ，离心转速为１００００－１２０００ｒ／ｍｉｎ、离心时间为５－１０ｍｉｎ，得到高纯度ＤＮＡ基因组，该基因组的Ａ↓［２６０／２８０］为１．７～１．９；　　③建立ＰＣＲ扩增反应体系：反应总体积为２０－２５μＬ，其中１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２－２．５μＬ、２５ｍＭＭｇＣｌ↓［２］　１．６－２．０μＬ、２ｍＭ　ｄＮＴＰ０．４－０．５μＬ、Ｔａｑ酶０．２５－０．４μＬ、５μＭ引物２μＬ、ＤＮＡ模板１μＬ；ＰＣＲ反应的退火温度为３６－３８℃，循环次数为４０－４５次；　　④确立中华鳖特征性分子标记：采用ＲＡＰＤ随机引物Ｓ１０４、Ｓ１０５、Ｓ３２７和Ｓ４７４作为区分不同地域中华鳖的特征性分子标记。

【技术特征摘要】
一种中华鳖DNA指纹鉴定方法，其特征在于包括下述步骤①肌肉样品预处理取待测中华鳖样品肌肉，对该肌肉在40-45℃温度烘干，烘干后的肌肉水分含量为3-5％；②提取基因组DNA采用试剂盒微量提取法提取上述烘干后的样品肌肉中的基因组DNA，提取条件为水浴温度为50-55℃、水浴时间为40-45min，离心转速为10000-12000r/min、离心时间为5-10min，得到高纯度DNA基因组，该基因组的A260/280为1.7～...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱国英，王忠华，
申请(专利权)人：钱国英，
类型：发明
国别省市：97[中国|宁波]