System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法技术_技高网

一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法技术

技术编号:41074108 阅读:15 留言:0更新日期:2024-04-24 11:31
本发明专利技术涉及分子生物学技术领域,尤其涉及IPC C12Q1,更具体地涉及,一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法。本发明专利技术提供了一种炭疽病菌高通量检测引物,包括上游引物Q‑ITSF和下游引物Q‑ITSR,也提供了一种炭疽病菌高通量定性定量检测方法,不仅可以快速鉴别出草莓病植株上的多种炭疽病菌,还可以精准计算出每株草莓病植株上的带菌量,从而指导选种育种工作,从源头切断病原菌的传播。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学,尤其涉及ipc c12q1,更具体地涉及,一种炭疽病菌高通量检测引物及定性定量检测方法


技术介绍

1、草莓炭疽病是草莓苗期的主要病害之一,危害草莓的匍匐茎、叶柄、叶片、托叶、花瓣、花萼和果实。草莓炭疽病菌容易潜伏侵染,连作地发病重,老残叶多、植株徒长、栽植过密、通风不良时易发病,植株发病容易造成大量的经济损失。随着草莓种植面积的扩大,草莓上的病害也得到了越来越多的关注,其中草莓根腐病最严重,由刺盘孢属、镰刀菌属、丝核菌属、疫霉菌属等多种病原菌引起。

2、现有的草莓炭疽病的防治方法通常通过化学药物手段进行病害防控,但随着炭疽病菌抗药性的不断增强,杀菌剂防治的效果不太理想,因此,草莓炭疽病的防治还需尽早在幼苗期发现,避免其传播为主。

3、现有专利cn201810021523.2公开了一种苗期草莓炭疽病潜伏侵染及其用药的快速检测法,“采用该方法能特异性检测出对qoi类杀菌剂高抗的草莓胶孢炭疽菌”;“而其他刺盘孢如黑色刺盘孢、平头炭疽菌和辣椒炭疽病菌均呈阴性反应”。但是,引起草莓炭疽病的病原菌至少有四种,包括果生炭疽病菌(colletotrichum fructicola)、暹罗炭疽病菌(c.siamense)、隐秘炭疽病菌(c.aenigma)和胶孢炭疽病菌(c.gloeosporioides)。因地域的不同,草莓炭疽病菌优势致病菌种类也不同;同时,同一株草莓幼苗可能存在上述的两种致病菌,引起复合侵染。由于草莓炭疽病菌存在潜伏侵染,但是,从外观上,带(炭疽病)菌苗与无菌苗一样,无法依赖目测进行甄别。一旦移栽带病苗,会在移栽的15天左右死亡,给种植户带来巨大损失。草莓幼苗的提供者也迫切需要能够对待售的草莓幼苗进行“体检”,以免客户“流失”和改进防控措施,培育无病壮苗。另一方面,草莓种植户也迫切需要一种技术,明确所购买的幼苗是否带菌。

4、因此,需要开发草莓炭疽病菌复合致病种的高通量的定量定性检测方法,辨别草莓幼苗是否携带炭疽病原菌,从而指导草莓炭疽病的科学防控。


技术实现思路

1、为了解决现有技术中的问题,本专利技术一方面提供了一种炭疽病菌高通量检测引物,包括上游引物q-itsf和下游引物q-itsr,所述q-itsf的引物序列为seq id no:1:tgatgtaggccctcaaaggtagcgg;所述q-itsr的引物序列为seq id no:2:attgggggttttacggcaagagagc(由上海生工生物工程有限公司)。

2、优选的,所述炭疽病菌高通量检测引物筛选方法:通过bioedit和mega 7.0.18软件对炭疽病菌和非炭疽病菌进行基因分析,prime5设计特异性引物,进行pcr验证,得到炭疽病菌高通量检测引物。

3、本专利技术中,设计特异性上游引物q-itsf和下游引物q-itsr,能够特异性识别炭疽病菌,不识别非炭疽病菌,同时,对多种不同种类的炭疽病菌均有识别作用。本专利技术人创造性的选择了6种阴性对照菌和6种阳性对照进行序列比对,发现c.siamense jr-1菌株的its序列在402bp-517bp与阳性对照菌株序列基本一致,而阴性对照序列出现了明显的不同,因此,研究选择了这段序列,花费了大量的时间和精力,在一定偶然因素的作用下,设计上游引物q-itsf和下游引物q-itsr,达到特异性识别的能力和高灵敏度,在常规pcr中最低检测限在1ng/μl,基因拷贝数达到3.8×1010/ul,而qpcr最低检测限在10pg/μl,基因拷贝数达到3.8×108/ul,是常规pcr灵敏度的100倍。

4、优选的,所述炭疽病菌包括刺盘孢属、镰刀菌属、腐霉菌属、葡萄孢属中的一种或多种。进一步优选的,所述炭疽病菌包括果生炭疽病菌(colletotrichum fructicola)、暹罗炭疽病菌(c.siamense)、隐秘炭疽病菌(c.aenigma)和胶孢炭疽病菌(c.gloeosporioides)、平头炭疽病菌(c.truncatum)、尖孢炭疽病菌(c.acutatum)。

5、优选的,所述炭疽病菌的数量为6种,所述非炭疽病菌的数量为6种。

6、优选的,所述6种炭疽病菌和6种非炭疽病菌的菌种基因信息见表1。

7、表1供试菌株

8、

9、

10、本专利技术中,通过特异性引物,可以同时鉴别出多种炭疽,所以适用范围广泛,即:胶孢炭疽病菌、尖孢炭疽病菌、果生炭疽病菌、平头炭疽病菌、暹罗炭疽病菌、隐秘炭疽病菌等多种炭疽菌都可以应用该检测体系。一般的炭疽病菌高通量定性定量检测中,只能检测出一种炭疽病菌,无法检测其它炭疽病菌,本专利技术中建立多种炭疽病菌的检测方法,能同时检测出6种炭疽病菌,筛选出草莓病植株上的炭疽菌概率增大,同时也降低了筛选成本。

11、本专利技术第二方面提供了一种炭疽病菌高通量定性定量检测方法,包括以下步骤:

12、s1:用基因组提取试剂盒提取草莓样本的dna;

13、s2:将标准样品和草莓样本进行常规pcr和qpcr检测,判断样本中的dna是否是炭疽菌,并定量检测炭疽菌的含量。

14、优选的,所述基因组提取试剂盒为天根植物基因组dna提取试剂盒,具体操作按试剂盒说明书进行。

15、优选的,所述s2中的具体步骤包括:对标准样品c.siamense jr-1菌株基因组进行qpcr扩增,配制标准样品初始浓度的初始浓度为1×106pg/μl、1×105pg/μl、1×104pg/μl、1×103pg/μl、1×102pg/μl、10pg/μl,分别取1μl为模板进行常规pcr反应(凝胶电泳法)与实时荧光定量pcr得到相应的ct值;绘制标椎曲线;然后,将草莓样品和标准菌株的dna模板进行常规pcr反应,1%琼脂糖电泳验证,然后利用qpcr测得样品ct值,然后代入标准曲线,求出草莓病植株携带炭疽菌的菌量。

16、优选的,所述标准菌株的dna模板是通过采用ctab法粗提供试菌株c.siamensejr-1的dna得到的。

17、优选的,所述供试菌株c.siamense jr-1由南京农业大学植物保护学院分离鉴定田间植株得到。

18、优选的,所述ctab法的具体步骤如下:

19、1)配pda培养基,高温灭菌,接种需要提取dna的菌。配ctab提取液(0.1mol/ltris-hcl,ph7.5;1%ctab:0.7mol/lnacl;10mmol/l edta)高温菌,实验时加入1%2-疏基醇)。

20、2)pda培养适当时间,将菌体导入10m1离心管12000转离心3min,滤纸吸水。吸除绝大部分水分。

21、3)在研钵中加入液氮,研磨至粉末。

22、4)加入预热的ctab 10ml,轻柔的颠倒混,65℃水浴1h(每隔10min摇一次),室温12000rpm,10min,吸取上清。

23、5)加入等体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,包括上游引物Q-ITSF和下游引物Q-ITSR,所述Q-ITSF的引物序列为SEQ ID NO:1:TGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGCGG;所述Q-ITSR的引物序列为SEQ ID NO:2:ATTGGGGGTTTTACGGCAAGAGAGC。

2.根据权利要求1所述的炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,所述炭疽病菌高通量检测引物筛选方法:通过BioEdit和MEGA 7.0.18软件对炭疽病菌和非炭疽病菌进行基因分析,Prime5设计特异性引物,进行PCR验证,得到炭疽病菌高通量检测引物。

3.根据权利要求2所述的炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,所述炭疽病菌包括刺盘孢属、镰刀菌属、丝核菌属、疫霉菌属炭疽病菌。

4.一种使用根据权利要求1~3任一项所述的炭疽病菌的引物的高通量定性定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

5.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述基因组提取试剂盒为天根植物基因组DNA提取试剂盒。

6.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述S2中的具体步骤包括:对标准样品Colletotrichum siamense基因组进行qPCR扩增,配制标准样品初始浓度的初始浓度为1×106pg/μL、1×105pg/μL、1×104pg/μL、1×103pg/μL、1×102pg/μL、10pg/μL,分别取1μL为模板进行常规PCR反应与实时荧光定量PCR得到相应的Ct值;绘制标椎曲线;然后,将草莓样品和标准菌株的DNA模板进行常规PCR反应,1%琼脂糖电泳验证,然后利用QPCR测得样品Ct值,然后代入标准曲线,求出草莓病植株携带炭疽菌的菌量。

7.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,常规PCR反应体系包括无菌水ddH2O:上游引物Q-ITSF:下游引物Q-ITSR:模板DNA:2×Taq Master Mix的体积比为(7~13):(0.8~1.2):(0.8~1.2):1:(10~15)。

8.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR反应体系中包括引物体系和DNA模板体系。

9.根据权利要求8所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述引物体系中包括2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、无菌水ddH2O、上游引物Q-ITSF、下游引物Q-ITSR;其中2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix:无菌水ddH2O:上游引物Q-ITSF:下游引物Q-ITSR体系比为(1.1~1.4):(8~12):(0.8~1.2):1。

10.根据权利要求8所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述DNA模板体系中包括2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix、无菌水ddH2O、模板DNA、50×ROXReference Dye 2的体系比为(4~5):(3~5):1:(0.3~0.5)。

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【技术特征摘要】

1.一种炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,包括上游引物q-itsf和下游引物q-itsr,所述q-itsf的引物序列为seq id no:1:tgatgtaggccctcaaaggtagcgg;所述q-itsr的引物序列为seq id no:2:attgggggttttacggcaagagagc。

2.根据权利要求1所述的炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,所述炭疽病菌高通量检测引物筛选方法:通过bioedit和mega 7.0.18软件对炭疽病菌和非炭疽病菌进行基因分析,prime5设计特异性引物,进行pcr验证,得到炭疽病菌高通量检测引物。

3.根据权利要求2所述的炭疽病菌高通量检测引物,其特征在于,所述炭疽病菌包括刺盘孢属、镰刀菌属、丝核菌属、疫霉菌属炭疽病菌。

4.一种使用根据权利要求1~3任一项所述的炭疽病菌的引物的高通量定性定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

5.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述基因组提取试剂盒为天根植物基因组dna提取试剂盒。

6.根据权利要求4所述的炭疽病菌高通量定性定量检测方法,其特征在于,所述s2中的具体步骤包括:对标准样品colletotrichum siamense基因组进行qpcr扩增,配制标准样品初始浓度的初始浓度为1×106pg/μl、1×105pg/μl、1×104pg/μl、1×103pg/μl、1×102pg/μl、10pg/μl,分别取1μl为模板进行常规pcr反应与实时...

【专利技术属性】
技术研发人员:陈长军叶文武王源超石伟山王光张龙
申请(专利权)人:南京农业大学
类型:发明
国别省市:

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