被二**英样化合物转化的Ah受体的免疫测定制造技术

本发明专利技术涉及一种在检测样品中检测出二＊英样化合物的方法。检测样品与一种由多种蛋白形成的异聚体接触，其中一种蛋白是活性Ａｈ受体。如果检测样品中存在二＊英样化合物，它们将与Ａｈ受体结合，导致后者脱离异聚体，形成含有活性Ａｈ受体与二＊英样化合物配体结合的复合体。然后检测复合体的存在。本发明专利技术的方法可通过利用固相俘获、竞争和夹心免疫检测试剂盒的形式进行。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测转化的Ah受体，以及随后通过检测转化的Ah受体而间接检测二噁英样化合物。
技术介绍
导言在最近的数十年里，二噁英已成为详细研究的热门课题。这归因于它们很大的毒性，以及据推测它们在环境中广泛的存在。对二噁英的毒理学研究主要集中在通过采用动物模型和细胞培养体系对它们的生物学活性进行研究。此外，二噁英对人类健康的潜在威胁还仅是通过对已知暴露于二噁英的人群进行流行病学研究的有限方法进行。从环境角度着眼于研究二噁英的产生、释放和降解。尽管在这些方面二噁英得到了广泛的研究，然而它们对生物系统的毒性的确切机制以及它们在环境中的分布范围尚不知晓。这部分是由于缺少评估生物系统暴露于二噁英及其相关化合物的简单方法。本专利技术的目的是克服本领域的这种缺陷。环境中的TCDD及其相关化学制品术语二噁英，通常为新闻媒体所采用，是2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英(″TCDD″)的缩写。TCDD仅仅是多氯化的二苯并-对-二噁英家族中的一员(即同类物)，而该家族具有75种可能的同类物，其结构随着氯原子的数目和位置而变化。引起混淆的来源是术语″二噁英″一词或者被用于专指TCDD，或者用于指整个多氯二苯并二噁英(PCDD)家族。从生物学上来讲，TCDD是最强的PCDD；多数其它的PCDD活性要弱10到上千倍。TCDD在所有PCDD同类物中是研究得最为深入的一种。一些芳香烃同TCDD具有相同的生物学特性，尤其是当其侧向位置被氯所取代时。这些化合物中最为重要的是多氯二苯并呋喃(″PCDF″)和某些多氯联苯家族(″PCB″)的成员。可能数目很大的PCDD(75)、PCDF(135)和PCB(20)的同类物使得环境分析变得复杂了，并且在能够采取此类分析前需要进行复杂的清除程序。在此所使用的″二噁英样化合物″包括所有上述所定义化合物家族的成员以及其它诱导相似细胞效应的化合物，例如偶氮苯和苯并芘。使用2，4，5-三氯苯氧基乙酸和2，4-二氯苯氧基乙酸脱叶剂，特别是通过在美国和越南所进行的森林喷洒计划，TCDD作为其产生的一种污染物在本世纪70年代早期引起了科学界和公众的注意。现有的TCDD检测技术在过去十年中检测二噁英样化合物的主要方法涉及使用物理-化学分析。这类方法通常包括一步或多步样品清除步骤以便从原始样本中提取出分析物，经气相色谱从与其它化合物的混合物中分离出感兴趣的分析物，通过质谱进行检测，并且与已知的合成标准物比较对分析物进行鉴定。这些步骤在R．E．Clement的“超痕量二噁英和二苯并呋喃分析30年来的进展”，分析化学，Vol．63，no．23(1991)和分析新闻(Sept／Oct 1992)中得到了综述。尽管很灵敏，但由于其高昂的价格(即每个样品达到2500美元)以及需要在中心实验室由熟练的操作者进行分析，这些技术并不适合筛选大批量的样品。此外，对二噁英样化合物进行物理-化学分析并不适合对含二噁英样化合物的混合物进行毒性预测，或对尚没有合成标准物存在的二噁英样化合物进行鉴定。另一种检测二噁英样化合物的方法是采用生物检测，即对活细胞或动物给予检测样品，然后分析细胞色素P450IA1活性的诱导-这种特性据认为可提示二噁英样化合物的存在。一系列的文献都公开了细胞系生物检测的方法。在D．E．Tillitt等“H4IIE大鼠肝癌细胞生物检测作为评估环境样品中平面卤化烃毒性强度的手段的特征”，环境科学技术，Vol 25，no．1，pp．87-92(1991)中，利用H4IIE大鼠肝癌细胞全面评估不同二噁英样化合物的毒性强度。当这种细胞被检测样品处理后，它们被采取分光荧光分析来检测芳香烃羟化酶和乙氧基试卤灵-正-脱乙基酶活性(细胞色素P450IA1诱导的指示物)。T．Zacharewski，“体外应用芳香烃羟化酶诱导分析法确定‘2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英的等价物’；被热解的溴化阻燃剂，”毒理学，51∶177-89(1986)(″Zacharewski″)总的来说与之相似。还采用了需要利用活动物的生物检测。在Zacharewski，大鼠注射检测样品并被处死。回收肝脏微粒酶部分，然后进行酶分析以检测芳香烃羟化酶或乙氧基试卤灵-正-脱乙基酶的诱导。虽然在文献中生物检测法已经被广泛地应用，它们却没得到实际的商业应用。这种方法主要的不足是需要活的细胞或动物，使它们不适合于采用商业检测试剂盒的方式。此外，P450IA1的酶检测法不是很灵敏而且需要复杂的仪器设备。由于存在上述与物理-化学分析和生物检测有关的问题，人们的注意力越来越集中于用体外检测法检测二噁英样化合物上。在C．A．Bradfield等的“对2，3，7，8-四氯二苯并-对-二噁英及Ah受体相关配体的竞争结合检测”，分子药理学，34∶682-88(1988)中，将来自C57BL／6J小鼠肝细胞溶胶的硫酸铵级份与检测样品和放射性配体2-碘代-7，8-二溴二苯并-对-二噁英共同孵育。然后游离的配体经活性炭处理后去除，而结合放射活性的配体通过闪烁计数器进行测量。这种方法具有很多缺点，包括需要获得使用放射性同位素的批准，以及需要设备用来检测和处置这些具有放射活性的材料。另外，这种检测只能测量与毒性无关的结合。在M．Vanderlaan等的“环境化学-用于筛选二噁英污染的环境样品的免疫检测的改进和应用”，环境毒理学和化学，vol．7，pp．859-70(1988)中，确定检测样品中二噁英样化合物的水平是通过单克隆抗体与二噁英样化合物自身结合的直接免疫检测。同时参见M．Vanderlaan，“环境科技评论综述-通过免疫检测进行环境监测”，环境科技，vol．22，no．3，pp．247-54(1988)。这种检测法并不是特别有用，因为它们不能区别结构可能相似的毒性和非毒性化学物质。Gierthy的美国专利号4，904，595涉及一种上皮细胞系及其在体外生物检测二噁英样活性的应用。当暴露于二噁英时，与受致命剂量照射的3T3细胞共同培养的XBF细胞系被诱导发生形态改变，变为扁平鹅卵石样，而与之对照的未经二噁英处理的培养细胞处于纺锭状高密度状态。Vanderlaan等的美国专利号4，798，807公开了与二噁英样化合物反应的单克隆抗体，以及使用这类抗体对这些化合物进行灵敏免疫检测的方法。这些抗体在竞争免疫检测中与二噁英样化合物识别并结合。Albro等的美国专利号4，238，472公开了一种放射免疫检测方法，用于检测环境样品中的二噁英样化合物。这种方法包括一抗与含有二噁英的样品(经去污剂乳化)结合，这种一抗可与二噁英和由放射活性I125标记的二噁英结合，形成抗体-I125-二噁英复合物。这使得标记的和未标记的二噁英与抗体竞争结合。复合物随后与二抗反应形成含二噁英的沉淀，沉淀中的放射活性经分析并利用曲线确定样品中的二噁英含量。另一种检测二噁英样化合物的方法是由M．M．Stantostefano等提出的，“配体结构对大鼠细胞溶胶芳香烃受体体外转化的影响”，生物化学和生物物理文献，vol．297，no．1，pp．73-79(1992)。如同其论文中图4所示，二噁英反应元件以及二噁英反应元件结合蛋白复合物的形成同应用凝胶移位分析中二噁英样化合物的浓度是相关的。尽管这种方法具有科学意义本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测测试样品中的多氯二苯并二＊英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二＊英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物的方法，包括：提供一种由多种蛋白形成的异聚体，其中一种蛋白为无活性状态的Ａｈ受体；检测样 品在一定条件下与异聚体接触，使样品中的多氯二苯并二＊英、多氯二苯并呋喃、多氯联苯及能表现多氯二苯并二＊英、多氯二苯并呋喃和多氯联苯生物学活性特征的其结构类似物作为配体与Ａｈ受体有效地结合，从而导致含有同配体结合的活性Ａｈ受体的复合体从异聚体脱离；并且检测所出现的含有同配体结合的活性Ａｈ受体的复合体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：GD维罗克，JG巴比斯，
申请(专利权)人：康乃尔研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]